本文關(guān)鍵詞：人源附睪蛋白酶抑制劑Eppin蛋白的可溶性表達，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人口問題是我國經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展的重要因素,因此避孕節(jié)育研究受到極大的重視。近年來,人類附睪蛋白酶抑制劑Eppin成為男性避孕研究中重要的候選物。人附睪蛋白酶抑制劑(Epidydimal protease inhibitor,Eppin)為分泌蛋白,在結(jié)構(gòu)上包含Kunitze和Wap兩個結(jié)構(gòu)域,主要在男性的附睪及睪丸中特異性表達。O’Rond等人于2004年的動物實驗中使用重組Eppin蛋白免疫雄猴,獲得78%的不育率,抗體高滴度維持數(shù)月后下降,72%雄猴恢復(fù)了致孕功能;隨后的研究發(fā)現(xiàn)在射精的過程中Eppin蛋白與精子凝固蛋白(Semenogelin,SEMG1)結(jié)合后調(diào)控來自前列腺的前列腺特異性抗原(Prostate Specific Antigen,PSA)專一水解SEMG1,并延緩其水解,使得精子處于凝膠保護中,維持精液微環(huán)境,免受女性陰道環(huán)境的攻擊,保證精子正常液化后獲能。同時有研究表明Eppin與SEMG1結(jié)合能減慢精子運動能力。抗Eppin抗體可能與SEMG1類似,特異性結(jié)合Eppin后由于PSA不能水解抗體,精子運動將永久性被抑制,從而導(dǎo)致免疫性不育。兩者結(jié)合位點所引起的構(gòu)象改變可能是其抗生育作用的機制。研究Eppin蛋白的三維結(jié)構(gòu),解析其構(gòu)象改變的分子基礎(chǔ)將為篩選出具有研發(fā)避孕疫苗潛能物提供重要條件。本課題擬表達足量可溶性Eppin重組蛋白為蛋白結(jié)晶做準備。第一部分分析了Eppin蛋白的氨基酸序列,并對二級結(jié)構(gòu)和二硫鍵配對進行預(yù)測。第二部分使用真核昆蟲桿狀病毒及果蠅S2表達體系表達Eppin蛋白。第三部分利用多種表達載體/宿主菌組合進行原核表達,在最佳誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度以及蛋白破碎方式上做了探索。最后以帶有麥芽糖結(jié)合蛋白MBP標簽的方式,借助表達菌株Rossetta2-OrigamiB(DE3)低溫誘導(dǎo)表達出首例可溶性Eppin蛋白。為獲取大量、純度高、可溶的Eppin蛋白,我們對pMALc質(zhì)粒進行改造,加入了TEV酶切位點以及在TEV與Eppin基因序列之間增加用于純化的組氨酸序列以加強酶切效率。蛋白純化方式包括了Ni柱、Amylose柱以及分子篩親和層析。實驗結(jié)果如下:1、Eppin蛋白的N端有具有柔性的無規(guī)則曲卷loop區(qū),相對C端較無序;預(yù)測將形成7對二硫鍵,分別為33-65、40-60、48-61、54-69、77-127、86-110、102-123。2、Eppin蛋白在昆蟲Bac-to-Bac桿狀病毒系統(tǒng)中以包涵體的方式表達于細胞內(nèi)。果蠅S2則無表達。3、成功構(gòu)建多個重組質(zhì)粒pET22b-Eppin、pET40b-Eppin、p ET28a-Eppin、pET32M-Eppin、p ET15a-Eppin,誘導(dǎo)表達后Eppin蛋白均表達為包涵體。4、成功構(gòu)建pMALc-2x-Eppin重組質(zhì)粒,表達可溶性重組MBP-Eppin蛋白,去除標簽后獲得首例可溶性Eppin蛋白,質(zhì)譜分析證實為Eppin蛋白,具有抗原性。5、可溶性Eppin蛋白以多聚體狀態(tài)與MBP共純化,用于Ni柱純化的組氨酸標簽未暴露。全長表達可溶性表達存在困難,后續(xù)研究可考慮以C端一部分序列作為蛋白結(jié)晶的研究。本研究對如何獲得可溶性Eppin蛋白進行了大量的實驗探索,同時也獲得了首例可溶性Eppin蛋白,為研究其三維結(jié)構(gòu)的測定及篩選出具有研發(fā)避孕疫苗潛能物提供重要實驗基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：避孕疫苗 Eppin 三維結(jié)構(gòu) 可溶性蛋白
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R169.41
【目錄】：

• 英文縮寫詞表4-6
• 英文摘要6-8
• 中文摘要8-10
• 第一章 前言10-12
• 第二章 Eppin蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析12-16
• 2.1 實驗方法12-13
• 2.2 結(jié)果13-15
• 2.3 討論15-16
• 第三章 Eppin基因真核表達體系的建立16-37
• 3.1 材料與方法16-27
• 3.2 結(jié)果27-35
• 3.3 討論35-37
• 第四章 Eppin基因原核表達體系的建立37-55
• 4.1 材料與方法37-45
• 4.2 結(jié)果45-52
• 4.3 討論52-55
• 全文總結(jié)55-56
• 參考文獻56-61
• 文獻綜述 關(guān)于人類附睪蛋白酶抑制劑(Eppin)蛋白的研究進展61-68
• 參考文獻66-68
• 碩士期間發(fā)表論文的情況68-69
• 致謝69

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張眾,黃華j;大腸桿菌二硫鍵形成相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及其在基因工程表達外源蛋白上的應(yīng)用[J];生物工程學(xué)報;2002年03期

2 ;Baculovirus as a highly efficient expression vector in insect and mammalian cells[J];Acta Pharmacologica Sinica;2005年04期

  本文關(guān)鍵詞：人源附睪蛋白酶抑制劑Eppin蛋白的可溶性表達，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：267349