【摘要】：飲食及環(huán)境中真菌毒素的污染是人類面臨的重要公共衛(wèi)生問題，它與人類疾病的發(fā)生關(guān)系密切。2006年，在對我國胃癌高發(fā)區(qū)之一的河北省贊皇縣（胃癌年均死亡率為77.67/10萬）居民食用小麥檢測時發(fā)現(xiàn)赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）的檢出率高達45.16%，當(dāng)?shù)鼐用馩TA的日暴露量為1.17μg/kg，遠遠超過世界衛(wèi)生組織/糧農(nóng)組織聯(lián)合專家委員會（Joint FAO/WHO Expert Committee on FoodAdditives，JECFA）暫定的每周允許攝入量100ng/kg。說明當(dāng)?shù)鼐用襁M食OTA污染糧食可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。 OTA是由曲霉菌屬和青霉菌屬的某些菌株產(chǎn)生的一種污染廣泛的真菌毒素，普遍存在于糧食、飲料、飼料和動物組織中。OTA化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在血液中的半衰期是35天。流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示OTA可能與巴爾干地方性腎病、慢性間質(zhì)性腎病和泌尿系上皮腫瘤有關(guān)。體內(nèi)、外實驗研究發(fā)現(xiàn)，OTA具有腎毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性和致畸性。因此，國際癌癥研究中心（InternationalAgency for Research on Cancer，IARC）將OTA列為“B級可能人類致癌物”。 研究發(fā)現(xiàn)許多致癌性真菌毒素早期毒性作用是導(dǎo)致細胞增殖抑制、細胞周期阻滯和凋亡。在針對OTA致胃癌可能機制的研究中，我們的前期體外實驗發(fā)現(xiàn)OTA可以抑制人胃黏膜上皮細胞GES-1細胞增殖，通過MAPK（p38，ERK）信號通路和ATM（ATM-Chk2，ATM-p53-p21WAF1/CIP1）信號通路介導(dǎo)G2期阻滯，并且誘導(dǎo)細胞凋亡。實驗揭示OTA誘導(dǎo)胃組織的靶細胞-胃黏膜上皮細胞細胞周期G2期阻滯可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。但是引起這一系列細胞級聯(lián)反應(yīng)的原因及其上游事件并不清楚。探討OTA這一生物學(xué)效應(yīng)可能對進一步認識其參與胃癌發(fā)生的可能機制具有重要意義。 OTA的潛在致癌性在二十世紀七十年代被認可，但是其致癌機制至今并不十分清楚。JECFA等專家組織在一些高度可能的機制中，越來越聚焦于氧化應(yīng)激機制。研究發(fā)現(xiàn)，很多致癌性真菌毒素都可以誘導(dǎo)細胞DNA氧化應(yīng)激損傷，進而導(dǎo)致細胞周期阻滯或凋亡。已有文獻報道OTA可以誘導(dǎo)人肝細胞和腎臟細胞DNA氧化應(yīng)激損傷�；钚匝酰╮eactiveoxygen species，ROS）對生物大分子（特別是DNA）的氧化損傷被認為是啟動和促進腫瘤發(fā)生的最重要因素。細胞周期檢測點的激活和修復(fù)系統(tǒng)的啟動是DNA損傷引發(fā)的細胞級聯(lián)反應(yīng)，這使得細胞在復(fù)制前或有絲分裂前有足夠的時間修復(fù)受損DNA，修復(fù)成功的細胞脫離周期阻滯進入細胞周期；修復(fù)失敗的細胞會發(fā)生凋亡，這對于維持基因組的穩(wěn)定性有重要意義。線粒體是細胞進行電子傳遞、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化產(chǎn)生能量的細胞器。同時也是氧化應(yīng)激損傷的靶細胞器，是產(chǎn)生ROS的主要部位，線粒體功能受損時ROS顯著增加。所以，OTA誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷可能在OTA誘發(fā)胃黏膜上皮細胞細胞周期阻滯的毒理學(xué)效應(yīng)中起重要作用。 為驗證這一假設(shè)，本研究在前期實驗的基礎(chǔ)上選取人胃黏膜上皮細胞株GES-1，從氧化應(yīng)激角度入手，首先觀察OTA對GES-1細胞內(nèi)ROS含量的影響，評價OTA誘導(dǎo)GES-1細胞DNA損傷的性質(zhì)及特征，基于抗氧化策略的DNA損傷靶向干預(yù)揭示OTA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與DNA損傷和G2期阻滯的關(guān)系；接著研究OTA對GES-1細胞線粒體損傷的影響，探討OTA誘導(dǎo)GES-1細胞ROS產(chǎn)生的分子機制。 腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多因素綜合作用的結(jié)果，在腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中免疫功能抑制發(fā)揮重要作用，免疫功能降低可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生幾率增加。致癌性霉菌毒素誘發(fā)機體的免疫毒性作用與腫瘤的發(fā)生具有密切關(guān)系。為了進一步驗證OTA誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷介導(dǎo)機體免疫細胞周期阻滯參與其免疫毒性作用，本研究選取人外周血單個核細胞（human peripheralblood mononuclear cells，hPBMC）作為研究對象，檢測OTA對hPBMC細胞的氧化應(yīng)激損傷作用和對細胞周期的影響及其可能分子機制。 本研究擬從OTA作用靶細胞和機體免疫細胞兩個方面揭示OTA誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷介導(dǎo)細胞周期阻滯的毒理學(xué)特性及其可能的分子機制，豐富和加深了人們對OTA生物效應(yīng)的認識，為OTA暴露的合理處置提供分子位點，這將有助于全面評價OTA在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的可能作用。 第一部分赭曲霉毒素A誘導(dǎo)GES-1細胞氧化應(yīng)激損傷介導(dǎo)G2期阻滯 目的：探討赭曲霉毒素A誘導(dǎo)人胃黏膜上皮細胞GES-1氧化應(yīng)激損傷作用，及ATM和MAPK信號通路在氧化應(yīng)激損傷介導(dǎo)GES-1細胞G2期阻滯中的調(diào)控作用。 方法：1采用熒光探針DCFH-DA和DHE檢測5、10、20μM OTA處理GES-1細胞24h后，細胞內(nèi)ROS含量。2采用超氧化物歧化酶（SOD）測試盒檢測OTA對GES-1細胞SOD活性的影響。3采用高效液相-電化學(xué)檢測技術(shù)、免疫熒光技術(shù)和Western blot方法分析OTA處理后GES-1細胞DNA的損傷情況。4在以上研究的基礎(chǔ)上給予抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）4mM預(yù)處理1h，觀察OTA處理對GES-1細胞ROS、SOD水平的影響及對DNA的損傷作用。5采用流式細胞術(shù)檢測NAC預(yù)處理對OTA作用后細胞周期的影響。6采用Western blot方法檢測NAC預(yù)處理對OTA作用后細胞周期關(guān)鍵調(diào)控分子Cdc25C、Cdc2和cyclinB1，信號通路ERK、p38MAPK、ATM蛋白表達及其磷酸化的變化情況。7采用免疫共沉淀技術(shù)檢測NAC預(yù)處理對Cdc2-cyclinB1復(fù)合物形成的影響。 結(jié)果： 1.1OTA對GES-1細胞ROS水平的影響 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，5、10、20μM OTA處理組DCF、DHE平均熒光強度均明顯高于對照組（P0.05）；抗氧化劑NAC預(yù)處理1h，DCF、DHE平均熒光強度明顯減低（P0.05）。結(jié)果提示，OTA誘導(dǎo)GES-1細胞ROS生成增多，NAC緩解了OTA的促ROS升高作用。 1.2OTA對GES-1細胞SOD活性的影響 SOD活性檢測結(jié)果表明，GES-1細胞經(jīng)OTA（5、10、20μM）處理24h，SOD活性分別為285.77±39.81、402.79±18.20、737.80±44.73U/mgprotein，顯著高于對照組157.51±12.49U/mg protein（P0.05）；4mM NAC預(yù)處理+10μM OTA處理組SOD活性較單獨10μM OTA處理組明顯降低（202.35±10.51vs394.74±16.12U/mg protein，P0.05）。 1.3OTA對GES-1細胞DNA損傷的影響 8-OHdG為氧化應(yīng)激損傷標(biāo)志物。高效液相-電化學(xué)檢測結(jié)果顯示，不同濃度OTA作用GES-1細胞24h，8-OHdG含量明顯較對照組升高（P0.05）。γ-H2AX為DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物，免疫熒光結(jié)果觀察到OTA處理組GES-1細胞形成了典型的γ-H2AX焦點。Western blot結(jié)果顯示，各個OTA處理組γ-H2AX蛋白表達上調(diào)（P0.05）。為了進一步明確ROS升高導(dǎo)致GES-1細胞DNA損傷，Western blot方法檢測了NAC預(yù)處理后γ-H2AX蛋白的變化情況。結(jié)果顯示，NAC+OTA處理組γ-H2AX蛋白表達水平明顯低于OTA處理組（P0.05）。綜合以上實驗結(jié)果表明，OTA誘導(dǎo)GES-1細胞DNA發(fā)生氧化損傷。 1.4NAC預(yù)處理對OTA作用后ATM表達的影響 為了進一步探討ROS誘導(dǎo)GES-1細胞DNA損傷參與了OTA激活A(yù)TM激酶，我們給予抗氧化劑NAC清除ROS。Western blot檢測結(jié)果顯示，NAC預(yù)處理組ATM磷酸化水平明顯低于單獨OTA處理組（P0.05），ATM蛋白表達水平則明顯高于OTA處理組（P0.05），說明抗氧化劑拮抗了OTA對GES-1細胞ATM激酶的激活作用。 1.5NAC預(yù)處理對OTA作用后ERK和p38MAPK信號通路的影響 為了進一步明確ROS參與了OTA處理對ERK和p38信號通路的激活作用，給予抗氧化劑NAC預(yù)處理，應(yīng)用Western blot方法檢測了ERK、p38蛋白及其磷酸化水平的變化。結(jié)果顯示，NAC預(yù)處理+OTA處理組ERK磷酸化水平和p38磷酸化水平顯著低于OTA處理組（P0.05），提示NAC拮抗了OTA對GES-1細胞ERK和p38MAPK信號通路的激活作用。 1.6NAC預(yù)處理對OTA作用后GES-1細胞周期的影響 為了進一步證明OTA誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷通過ATM和MAPK途徑介導(dǎo)GES-1細胞發(fā)生G2期阻滯，在前面NAC拮抗了OTA對GES-1細胞ATM和MAPK（ERK和p38）通路激活的基礎(chǔ)上，本研究在給予抗氧化劑NAC預(yù)處理后，觀察了OTA對GES-1細胞周期及周期調(diào)控蛋白的影響。流式細胞術(shù)細胞周期檢測結(jié)果顯示，NAC預(yù)處理組G2/M期的細胞比例較10μM OTA處理組顯著減少（P0.05）。結(jié)果提示NAC預(yù)處理可以部分逆轉(zhuǎn)OTA誘導(dǎo)的GES-1細胞G2期阻滯。 Western blot結(jié)果顯示，NAC預(yù)處理后，GES-1細胞Cdc25C、Cdc2和cyclinB1的蛋白表達水平及p-Cdc25C和p-Cdc2水平均較10μM OTA單獨處理組明顯升高（P0.05）。結(jié)果表明NAC緩解了OTA對的G2期關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子（Cdc25C、Cdc2和cyclinB1）的抑制作用。 實驗結(jié)果揭示OTA誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷可能通過ATM和MAPK途徑介導(dǎo)GES-1細胞發(fā)生G2期阻滯。 第二部分赭曲霉毒素A對GES-1細胞線粒體的損傷作用 目的：線粒體是產(chǎn)生ROS的重要細胞器，其損傷啟動細胞的氧化應(yīng)激損傷，本部分探討OTA對GES-1細胞線粒體DNA、功能的影響。 方法：1采用超氧化物歧化酶（SOD）分型測試盒檢測5、10、20μMOTA處理24h，GES-1細胞MnSOD活力變化情況。2高效液相-電化學(xué)檢測線粒體DNA（mtDNA）中8-OHdG含量的變化。3Real-time PCR檢測mtDNA編碼的呼吸鏈上的13個亞基（ND1，ND2，ND3，ND4，ND4L，ND5，ND6，COXⅠ，COXⅡ，COXⅢ，Cytb，ATP6，ATP8）mRNA水平變化情況。4采用線粒體呼吸鏈復(fù)合體I活性比色法定量檢測試劑盒檢測呼吸鏈復(fù)合體I活性。5采用Oxygraph-2k液相氧電極測定透膜細胞中線粒體氧耗速率。6羅丹明123染色，流式細胞術(shù)檢測線粒體膜電位的變化。7Annexin V-FITC染色，，流式細胞術(shù)檢測GES-1細胞凋亡情況。8Western blot檢測MnSOD、堿基切除修復(fù)基因OGG1和凋亡因子Bax、Bcl-2、Bcl-xL、cytochrome c、caspase-9的表達情況。9給予GES-1細胞抗氧化劑4mM NAC預(yù)處理1h，檢測OTA對GES-1細胞凋亡的影響。 結(jié)果： 2.1OTA對GES-1細胞MnSOD的影響 MnSOD是線粒體中清除ROS的主要抗氧化酶。Western blot結(jié)果顯示，各個OTA處理組MnSOD蛋白條帶逐漸增強，明顯高于對照組（P0.05）。MnSOD酶活性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5、10、20μM OTA處理組MnSOD活性分別為115.26±9.83，162.63±13.18和285.04±3.10U/mgprotein，顯著高于對照組64.73±4.42U/mg protein（P0.05）。 2.2OTA對GES-1細胞mtDNA8-OHdG水平的影響 應(yīng)用高效液相-電化學(xué)檢測技術(shù)檢測8-OHdG，用以分析OTA對mtDNA的氧化損傷。結(jié)果顯示OTA處理組8-OHdG水平明顯較對照組升高（P0.05）。提示OTA誘導(dǎo)GES-1細胞mtDNA發(fā)生氧化損傷。 2.3OTA對GES-1細胞線粒體中OGG1蛋白水平表達的影響 Western blot結(jié)果顯示，OTA5、10、20μM處理組線粒體中OGG1蛋白條帶較對照組顯著減弱（P0.05）。結(jié)果提示，OTA抑制線粒體堿基切除修復(fù)途徑。 2.4OTA對線粒體基因表達的影響 Real-time PCR檢測了線粒體DNA編碼的氧化呼吸鏈復(fù)合體的13個亞基mRNA水平的變化。5、10μM OTA處理組各亞基mRNA水平無明顯變化（0.5＜Fold change＜1.5）；20μM OTA處理組復(fù)合體I亞基ND1、ND2、ND3、ND4L、ND5和ND6mRNA表達水平較對照組明顯升高（Foldchange＞1.5），ND4mRNA變化不明顯；復(fù)合體III亞基cytb和復(fù)合體IV亞基COXI、COXII、COXIII mRNA無明顯變化（0.5＜Fold change＜1.5）；復(fù)合體V亞基ATP6mRNA水平明顯升高（Fold change＞1.5），ATP8mRNA水平無明顯變化（0.5＜Fold change＜1.5）。 2.5OTA對線粒體呼吸鏈復(fù)合體I活性的影響 Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)OTA主要誘導(dǎo)呼吸鏈復(fù)合體I亞基mRNA表達升高，為了進一步明確OTA對復(fù)合體I的影響，對其活性進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各OTA處理組（5、10、20μM）復(fù)合體I活性均明顯低于對照組（P0.05），提示OTA抑制了線粒體呼吸鏈復(fù)合體I活性。 2.6OTA對線粒體呼吸的影響 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5、10、20μM OTA處理組線粒體ST3呼吸速率均較對照組顯著降低（P0.05）；ST4呼吸速率無明顯變化；10和20μM OTA處理組呼吸控制比（RCR）與對照組相比明顯降低（P0.05），提示OTA抑制了GES-1細胞線粒體呼吸功能。 2.7OTA對GES-1細胞凋亡的影響 因為線粒體損傷后會啟動線粒體途徑介導(dǎo)細胞凋亡，本實驗進一步驗證OTA致線粒體損傷誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致細胞通過線粒體途徑凋亡。 2.7.1OTA對線粒體膜電位（ΔΨm）的影響 線粒體膜電位降低是線粒體功能障礙的特點，是細胞凋亡的早期事件之一。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，OTA處理明顯減低了羅丹明123的平均熒光強度（P0.05）。為了探討ROS是否參與了ΔΨm的變化，抗氧化劑NAC預(yù)處理細胞1h再給予10μM OTA孵育24h，羅丹明123平均熒光強度較單獨10μM OTA處理組明顯升高（P0.05）。提示OTA誘導(dǎo)ROS生成增加介導(dǎo)了GES-1細胞線粒體膜電位降低。 2.7.2NAC對OTA誘導(dǎo)GES-1細胞凋亡的影響 為了進一步明確OTA通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)GES-1細胞凋亡，實驗采用抗氧化劑NAC預(yù)處理來減少ROS。Annexin V-PI雙染法檢測結(jié)果顯示，10μM OTA處理組細胞凋亡率為12.67±2.12%，明顯高于對照組3.03±0.77%；4mM NAC+10μM OTA處理組細胞凋亡率為5.56±1.80%，較10μM OTA處理組顯著降低（P0.05）。 2.7.3OTA對凋亡相關(guān)蛋白的影響 為了研究線粒體途徑是否參與了OTA誘導(dǎo)的GES-1細胞凋亡，我們首先檢測了促凋亡基因Bax和抑凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL的蛋白水平變化。Western blot檢測結(jié)果顯示，OTA處理增加了Bax蛋白水平；相反，降低了Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表達量（P0.05）。NAC預(yù)處理1h， NAC+OTA處理組Bax蛋白表達較相應(yīng)的OTA處理組明顯降低，而Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表達明顯升高（P0.05）。 Cytochrome c從線粒體釋放到細胞胞漿是線粒體凋亡途徑級聯(lián)反應(yīng)的一個關(guān)鍵步驟，激活下游的caspase。Western blot分別檢測了線粒體部分和胞漿部分cytochrome c的蛋白變化情況。OTA暴露24h，線粒體中cytochrome c蛋白表達量明顯減少；同時，胞漿中cytochrome c表達量明顯增加（P0.05）。NAC抗氧化劑預(yù)處理后，和相應(yīng)的單獨OTA處理組相比，NAC+OTA處理組線粒體部分cytochrome c蛋白表達量明顯升高，胞漿部分明顯減少（P0.05）。 釋放到胞漿的cytochrome c激活caspase-9。各種濃度OTA處理GES-1細胞后，非活性procaspase-9蛋白表達降低，而活性形式表達增強（P0.05）。NAC明顯逆轉(zhuǎn)了OTA對caspase-9的激活作用（P0.05）。 綜合以上實驗結(jié)果，提示OTA通過氧化應(yīng)激激活線粒體途徑介導(dǎo)GES-1細胞凋亡。 第三部分赭曲霉毒素A誘導(dǎo)人外周血單個核細胞DNA氧化損傷及其介導(dǎo)G1期阻滯 目的：探討OTA對人外周血單個核細胞（hPBMC）的氧化應(yīng)激損傷作用及其毒理學(xué)效應(yīng)。 方法：1采用熒光探針DCFH-DA和DHE，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測OTA（5，10，20μM）處理24h對hPBMC細胞ROS含量的影響。2采用谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒檢測hPBMC細胞內(nèi)GSH水平的變化。3采用高效液相-電化學(xué)方法、堿性彗星實驗及Western blot技術(shù)檢測hPBMC細胞DNA的損傷情況。3采用流式細胞術(shù)檢測OTA對hPBMC細胞周期的影響。4采用Western blot方法檢測OTA作用后細胞周期關(guān)鍵調(diào)控分子CDK4和cyclinD1在蛋白水平的表達變化。5應(yīng)用流式細胞術(shù)、Hoechst33258熒光染色分析OTA對hPBMC細胞凋亡的影響。6給予抗氧化劑NAC預(yù)處理后重復(fù)上述實驗，探討氧化應(yīng)激參與了OTA的生物效應(yīng)。 結(jié)果： 3.1OTA對hPBMC細胞ROS的影響 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，5、10、20μM OTA處理24h后，DCF和DHE的平均熒光強度均明顯增加（P0.05）。給予4mM NAC預(yù)處理1h，20μMOTA+4mM NAC處理組DCF的平均熒光強度顯著低于20μM OTA單獨處理組；DHE的平均熒光強度較OTA單獨處理組也顯著降低（P0.05）。提示OTA處理可以誘導(dǎo)ROS生成增加，此作用可以被抗氧化劑NAC緩解。 3.2OTA對hPBMC細胞內(nèi)GSH含量的影響 給予不同濃度OTA處理24h后，hPBMC細胞內(nèi)GSH含量明顯較對照組降低（P0.05）。NAC預(yù)處理組GSH水平較OTA處理組明顯升高（P0.05）。因為NAC是巰基化合物，既可以直接清除自由基，又能參與還原型谷胱甘肽的合成，本實驗提示NAC可以保護hPBMC細胞，防止OTA導(dǎo)致GSH含量降低，進一步證明OTA對hPBMC的氧化應(yīng)激作用。 3.3OTA對hPBMC細胞DNA損傷的影響 高效液相-電化學(xué)檢測結(jié)果顯示，各種濃度OTA處理組中8-OHdG的水平明顯高于對照組（P0.05）。 熒光顯微鏡下觀察堿性彗星實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OTA處理組細胞電泳后出現(xiàn)了“彗星”現(xiàn)象，彗星拖尾明顯；20μM OTA+4mM NAC處理組細胞彗星尾部小于OTA處理組。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，各處理組hPBMC細胞彗星的Tail DNA%、Tail Length及Olive Tail Moment值均明顯高于溶劑對照組（P0.05）�？寡趸瘎㎞AC預(yù)處理1h，上述指標(biāo)均顯著降低（P0.05）。 Western blot結(jié)果顯示，5、10、20μM OTA處理組γ-H2AX蛋白表達明顯增加（P0.05）。NAC預(yù)處理明顯下調(diào)γ-H2AX表達（P0.05）。 上述結(jié)果表明OTA誘導(dǎo)hPBMC細胞DNA發(fā)生氧化損傷。 3.4OTA對hPBMC細胞周期的影響 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10、20μM OTA處理組G1期細胞比例分別為52.27±3.00%、52.67±1.45%，顯著高于對照組31.03±7.88%（P0.05）。NAC預(yù)處理后，NAC+OTA處理組G1期細胞比例較OTA處理組顯著降低（37.07±2.48%vs48.30±2.07%，P0.05）。 Western blot結(jié)果顯示，OTA處理可以降低hPBMC細胞cyclinD1和CDK4蛋白表達（P0.05）。4mM NAC預(yù)處理+20μM OTA處理組cyclinD1和CDK4蛋白表達均較單獨20μM OTA處理組明顯提高（P0.05）。 綜合實驗結(jié)果表明OTA誘導(dǎo)hPBMC細胞發(fā)生G1期阻滯，抑制cyclinD1和CDK4蛋白表達；NAC可以逆轉(zhuǎn)OTA對cyclinD1和CDK4蛋白表達的抑制作用，從而緩解G1期阻滯。 3.5OTA對hPBMC細胞凋亡的影響 流式細胞術(shù)細胞周期檢測結(jié)果顯示，hPBMC細胞經(jīng)5、10、20μM OTA處理24h后，OTA各處理組細胞凋亡率分別為5.99±1.54%、7.07±1.30%和11.84±1.51%，均高于溶劑對照組3.77±0.38%（P0.05）。NAC預(yù)處理，部分緩解了OTA的促凋亡作用（7.12±0.94%vs17.81±1.23%，P0.05）。 熒光顯微鏡下觀察Hoechst33258熒光染色法凋亡細胞形態(tài)學(xué)改變，20μM OTA作用24h后，hPBMC細胞胞核出現(xiàn)核固縮、碎裂，產(chǎn)生凋亡小體，NAC預(yù)處理組沒有觀察到明顯的細胞核改變。 結(jié)果提示，OTA誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激損傷介導(dǎo)對hPBMC的促凋亡作用。 結(jié)論： 1OTA可以誘導(dǎo)GES-1細胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。 2OTA誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激損傷通過ATM和MAPK通路參與其誘導(dǎo)GES-1細胞G2期阻滯的發(fā)生。 3OTA誘導(dǎo)GES-1細胞線粒體DNA損傷，抑制堿基切除修復(fù)功能，呼吸功能降低；這可能是GES-1細胞ROS水平升高、發(fā)生氧化應(yīng)激損傷的重要原因。 4OTA激活線粒體途徑誘導(dǎo)GES-1細胞發(fā)生凋亡。 5OTA可以誘導(dǎo)hPBMC細胞ROS生成增多，發(fā)生DNA氧化損傷，進而介導(dǎo)hPBMC細胞G1期阻滯和凋亡。這可能參與了OTA的免疫抑制生物效應(yīng)。 6OTA通過誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷作用介導(dǎo)胃組織靶細胞和機體免疫細胞細胞周期阻滯和凋亡，這一毒理學(xué)效應(yīng)可能與OTA參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展具有密切關(guān)系。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R735.2;R155.5

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 李增寧;楊惠霞;張祥宏河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)所實驗病理室;康維鈞;談敦芳;崔晉峰;王俊靈;申海濤;汲建軍;米建民;;河北省食管癌、胃癌高發(fā)區(qū)居民食用小麥赭曲霉素A污染情況分析[J];衛(wèi)生研究;2006年06期

2 張祥宏,趙文元,嚴霞,王俊靈,米建民,張振國,謝同欣,孫旭明,曹文軍,王鳳榮,三角順一,青木一雄;河北省贊皇縣胃癌高、低發(fā)區(qū)居民血清胃蛋白酶原、胃泌素和幽門螺桿菌抗體檢測[J];中華消化雜志;1999年03期

本文編號：2181189