【摘要】：背景:眾所周知,天然食物來源的抗氧化物,尤其是抗氧化植物化學物質(zhì),被認為是無害的天然抗氧化劑,其對一系列的慢性健康問題,如衰老、心血管疾病和癌癥等,都具有明顯的預防治療作用。近年來,來源于食物的天然抗氧化物引起了廣大研究人員的興趣,尤其是那些可減緩衰老和降低年齡相關(guān)性退行性疾病風險的抗氧化物越來越受到關(guān)注。許多抗氧化物,比如酚類化合物(例如多酚類、類黃酮類和單寧類)、類胡蘿卜素、有機酸和多糖等,已被發(fā)現(xiàn)存在于很多天然植物資源中,并且已經(jīng)被廣泛應用于食物和藥物之中。CD提取自紫色絲膜菌(家族:絲膜菌科),具有顯著的抗氧化效果,對氧化應激誘導PC-12細胞損傷具有較強的保護作用。CD在抗氧化應激損傷中具有的優(yōu)勢,使其可能為年齡相關(guān)性退行性疾病的治療提供了一個新的解決方案或思路。目的:探討絲膜菌提取物CD對H_2O_2誘導PC-12細胞氧化應激損傷的保護作用與分子機制。明確CD對神經(jīng)元性PC-12細胞內(nèi)ROS變化的影響,探究線粒體來源的ROS信號在H_2O_2誘導的PC-12細胞凋亡過程當中的作用,從而進一步探討研究CD可能的神經(jīng)細胞保護作用機制。方法:1.在96孔板中用不同濃度的H_2O_2(50,100,150,200,250,300μmol/L)處理PC-12細胞,分別作用2h、4h、6 h、12 h、24 h和48 h后,加入10μL/孔的MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,中文化學名為3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽,商品名:噻唑藍)孵育細胞,去除培養(yǎng)液,加入150μL/孔的二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)溶解,應用酶標儀檢測吸光度來檢測細胞活性;2.H_2O_2(150μmol/L)處理PC-12細胞2 h后,去除培養(yǎng)液,加入含維生素C(Vitamin C,Vc)(150μmol/L)或CD(4μg/m L)的培養(yǎng)液處理PC-12細胞12 h小時后,應用MTT試驗檢測細胞活性;3.H_2O_2(150μmol/L)處理PC-12細胞2 h后,去除培養(yǎng)液,加入含Vc(150μmol/L)或CD(4μg/m L)的培養(yǎng)液處理PC-12細胞12 h小時后,使用DCFH-DA(二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯)孵育后應用熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)ROS分布水平,應用流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)ROS變化程度;4.H_2O_2(150μmol/L)處理PC-12細胞2 h后,去除培養(yǎng)液,加入含Vc(150μmol/L)或CD(4μg/m L)的培養(yǎng)液處理PC-12細胞12 h小時后,應用DNA染料熒光染料Hoechst 33342染細胞核,在熒光顯微鏡下觀察不同分組的細胞核的變化;5.H_2O_2(150μmol/L)處理PC-12細胞2 h后,去除培養(yǎng)液,加入含Vc(150μmol/L)或CD(4μg/m L)的培養(yǎng)液處理PC-12細胞12 h小時后,JC-1染色后,應用熒光顯微鏡觀察細胞膜電勢變化水平,應用流式細胞術(shù)檢測線粒體膜電勢變化程度;6.H_2O_2(150μmol/L)處理PC-12細胞2 h后,去除培養(yǎng)液,加入含Vc(150μmol/L)或CD(4μg/m L)的培養(yǎng)液處理PC-12細胞12 h小時后,應用Western blot(蛋白質(zhì)印跡法)檢測線粒體介導凋亡相關(guān)蛋白PARP-1(多聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶的裂解片段1,poly ADP-ribose polymeras-1),Bax(Bcl2-Associated X protein),Bcl-2(B淋巴細胞瘤-2基因,B-cell lymphoma-2),caspase-3(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3,cysteinyl aspartate specific proteinase-3)和caspase-9(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9,cysteinyl aspartate specific proteinase-9)蛋白在PC-12細胞中的表達。結(jié)果:1.成功建立了H_2O_2誘導PC-12細胞氧化應激損傷模型;2.H_2O_2抑制PC-12細胞活性并誘導細胞凋亡,聯(lián)合應用Vc或CD后,減低了H_2O_2對PC-12細胞的毒性效應;3.H_2O_2使PC-12細胞ROS水平增加,具有濃度和時間依賴性,聯(lián)合應用Vc或CD后,PC-12細胞的ROS水平明顯降低;4.CD能夠抑制H_2O_2誘導PC-12細胞凋亡,減少H_2O_2所致的胞內(nèi)ROS升高,降低由線粒體功能障礙導致的凋亡;5.H_2O_2降低PC-12細胞的線粒體膜電勢,導致線粒體功能障礙,最終導致細胞凋亡,聯(lián)合應用Vc或CD后,抑制PC-12細胞的線粒體膜電勢下降;6.H_2O_2上調(diào)PC12細胞凋亡蛋白PARP-1、cleaved caspase-3、caspase-9和Bax的表達,聯(lián)合應用Vc或CD降低H_2O_2誘導的PARP-1、cleaved caspase-3、caspase-9和Bax的表達水平;7.H_2O_2下調(diào)PC12細胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,聯(lián)合應用Vc或CD上調(diào)PC-12細胞內(nèi)Bcl-2的表達水平,增強了細胞活力,降低了細胞凋亡。
[Abstract]:Background: it is well known that natural food sources of antioxidants, especially antioxidant phytochemicals, are considered as harmless natural antioxidants, which have obvious preventive treatment for a series of chronic health problems, such as aging, cardiovascular disease and cancer. In recent years, natural antioxidants derived from food have been caused by the natural antioxidants. Many antioxidants, especially those that reduce the risk of aging and age related degenerative diseases, have attracted more and more attention. Many antioxidants, such as phenols, flavonoids and tannins, carotenoids, organic acids and polysaccharides, have been found in many natural plants. .CD has been widely used in food and medicine, and has been widely used in food and medicine. It has a significant antioxidant effect. It has a strong protective effect on oxidative stress induced PC-12 cell damage and.CD has some advantages in antioxidant stress injury, which may be an age related degenerative disease. The treatment of the disease provides a new solution or idea. Objective: To explore the protective effect and molecular mechanism of CD on oxidative stress injury induced by H_2O_2 in PC-12 cells. The effect of CD on the changes of ROS in neuronal PC-12 cells, and to explore the ROS letter number derived from mitochondria in the process of PC-12 cell apoptosis induced by H_2O_2 To further explore the possible mechanism of the neuroprotective effect of CD. Methods: 1. in 96 Kong Banzhong, PC-12 cells were treated with different concentrations of H_2O_2 (50100150200250300 mu mol/L), and 2H, 4h, 6 h, 12 h, 24 h and 48 h were added to the 10 micron L/ aperture. Omide, the Chinese chemical was named 3- (4,5- two methyl thiazole -2) -2,5- two phenyl tetrazolium bromide, the commodity name: thiazolium incubated cells, the culture solution was removed, the two methyl sulfoxide (Dimethyl Sulfoxide, DMSO) was dissolved in the 150 mu L/ hole, and the activity of the cell was detected by the enzyme labeling instrument. The 2.H_2O_2 (150 mu mol/L) treated 2 PC-12 cells and removed the culture. After adding vitamin C (Vitamin C, Vc) (150 mu mol/L) or CD (4 g/m L) to treat PC-12 cells for 12 h hours, MTT test was used to detect cell activity. After 3.H_2O_2 (150 mu) treated 2 cells, the culture solution containing 150 mu (150 mu) or 4 micron (4 mu) was used to treat 12 hours. After incubation with two chloro two fluorescein acetoacetate (two chlorofluorescein acetoacetate), the intracellular ROS distribution was observed by fluorescence microscopy, and the changes in intracellular ROS were detected by flow cytometry. After 2 h of PC-12 cells were treated with 4.H_2O_2 (150 mu mol/L), the culture solution was removed and the incubating liquid containing Vc (150 u mol/L) or CD (4 mu g/m L) was used to treat 12 hours of PC-12 cells. NA dyestuff dye Hoechst 33342 dyed the nucleus and observed the changes of nuclei in different groups under the fluorescence microscope; after 5.H_2O_2 (150 mol/L) treatment of PC-12 cells 2 h, the culture solution was removed, the medium containing Vc (150 mu) or CD (4 mu g/m L) was added to the PC-12 cells for 12 hours. After dyeing, the cell membrane was observed by fluorescence microscope. The level of potential change was measured by flow cytometry. After 6.H_2O_2 (150 mu mol/L) treatment of PC-12 cells 2 h, the culture solution was removed, and PC-12 cells were treated with Vc (150 mu mol/L) or CD (4 u g/m L) to treat PC-12 cells for 12 h hours. -1 (lysate fragment 1, poly ADP-ribose polymeras-1), Bax (Bcl2-Associated X protein), Bcl-2 (B lymphocyte tumor -2 gene, B-cell), and cysteine (cysteine containing aspartate protein hydrolase 3) and cysteine The expression of aspartate protein hydrolase 9, cysteinyl aspartate specific proteinase-9) protein in PC-12 cells. Results: 1. the H_2O_2 induced oxidative stress damage model of PC-12 cells was successfully established, 2.H_2O_2 inhibited the activity of PC-12 cells and induced apoptosis, and the toxic effect of H_2O_2 on the cells was reduced after the joint application of Vc or CD; 3. H_2O_2 increased the level of ROS in PC-12 cells and had a concentration and time dependence. After the combination of Vc or CD, the ROS level of PC-12 cells decreased significantly. 4.CD could inhibit H_2O_2 induced apoptosis of PC-12 cells, reduce intracellular ROS increase caused by H_2O_2 and reduce apoptosis induced by mitochondrial dysfunction, and reduce mitochondrial membrane electricity. Potential, leading to mitochondrial dysfunction, and eventually leading to apoptosis, combined with Vc or CD, to inhibit the decrease of mitochondrial membrane potential in PC-12 cells; 6.H_2O_2 up regulation of the expression of PC12 cell apoptotic protein PARP-1, cleaved Caspase-3, caspase-9 and Bax The expression of anti apoptotic protein Bcl-2 in PC12 cells was down regulated by 7.H_2O_2. The expression of Bcl-2 in PC-12 cells was up-regulated by Vc or CD, and cell viability was enhanced and apoptosis was reduced.
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R151

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本文編號：2152283