【摘要】：鉛是常見的環(huán)境重金屬污染物，具有顯著的神經(jīng)毒性。近年來研究證實：鉛在某些神經(jīng)退行性疾�。ㄈ鏟D、AD等）的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用，其機制可能與誘導細胞氧化應(yīng)激、擾亂神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及其受體的表達和功能、擾亂細胞能量代謝等有關(guān)。因此深入研究鉛暴露產(chǎn)生的神經(jīng)毒性，闡明其作用機制，探討可能的防治措施，是預防醫(yī)學亟待解決的重大課題。 誘導氧化應(yīng)激反應(yīng)是鉛神經(jīng)毒性的重要機制之一。但是鉛離子本身并不具有強氧化性，因此我們推測鉛所誘導的氧化應(yīng)激反應(yīng)可能是一種間接作用。銅是人體必需的微量元素，但是，細胞中過量的銅可以導致細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的增強，從而在多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起到重要的促進作用。血腦脊液屏障（Blood-cerebrospinal fluid barrier, BCB）分隔血液和腦脊液，限制其間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運，對維持大腦中銅的內(nèi)環(huán)境平衡也起到關(guān)鍵作用。以往研究表明，鉛暴露可以改變大腦銅離子內(nèi)環(huán)境平衡，引起神經(jīng)細胞銅的蓄積。細胞銅的代謝主要由銅轉(zhuǎn)運體調(diào)控，包括銅轉(zhuǎn)運體1（copper transporter1, CTR1）、二價金屬轉(zhuǎn)運體1（divalent metaltransporter1, DMT1）、抗氧化蛋白1（antioxidant1copper chaperone, ATOX1）和銅轉(zhuǎn)運ATP酶（如ATP7A、ATP7B）等，上述銅轉(zhuǎn)運體蛋白在脈絡(luò)叢上皮細胞中均有表達。近年來，國內(nèi)外許多學者就銅離子內(nèi)環(huán)境失衡所致毒性效應(yīng)的機制進行了大量研究，但其確切的機制仍不十分明確。 綜上所述，我們推測鉛暴露可能通過改變這些銅轉(zhuǎn)運體的表達，擾亂中樞神經(jīng)系統(tǒng)中銅的內(nèi)環(huán)境平衡。本研究以SD大鼠和大鼠脈絡(luò)叢上皮細胞系Z310為實驗對象，探討CTR1、ATP7A等銅轉(zhuǎn)運體在鉛誘導脈絡(luò)叢上皮細胞銅蓄積中的作用，以及銅失衡在鉛誘導的細胞氧化應(yīng)激中的作用。本研究將為闡明鉛暴露導致大腦銅離子代謝紊亂及氧化應(yīng)激損傷的分子機制提供研究基礎(chǔ)。 目的： 本研究通過建立慢性鉛暴露大鼠模型和脈絡(luò)叢上皮細胞系Z310模型，研究鉛暴露改變BCB中銅內(nèi)環(huán)境平衡的機制，探討CTR1、ATP7A等銅轉(zhuǎn)運體在鉛誘導脈絡(luò)叢上皮細胞銅蓄積中的作用，以及銅失衡在鉛誘導的細胞氧化應(yīng)激中的作用。本研究將為闡明鉛暴露導致大腦銅離子代謝紊亂及氧化應(yīng)激損傷的分子機制提供研究基礎(chǔ)。 方法： 1.建立動物模型和細胞模型 1)動物模型：將21日齡SD大鼠隨機分為室溫對照組（16只）和鉛暴露組（16只），參考前期實驗和文獻報道確定染毒劑量為100ppm Pb(AC)2；染毒方法為飲水法。 2)細胞模型：大鼠脈絡(luò)叢上皮細胞系Z310，MTT法篩選鉛染毒劑量，根據(jù)結(jié)果我們在后續(xù)的實驗中選擇0、2.5、5、10μmol/L作為鉛暴露的濃度。 2.采用原子吸收分光光度法檢測鉛暴露大鼠血液、腦脊液、大腦組織中鉛、銅的含量；采用放射性同位素吸收實驗Gamma計數(shù)法檢測鉛暴露對Z310細胞銅吸收的影響。 3.采用總SOD活性檢測試劑盒和MDA檢測試劑盒，檢測鉛對細胞SOD活性和MDA含量的影響。 4.采用免疫熒光染色法檢測脈絡(luò)叢組織中CTR1、ATP7A的表達水平；用Westernblot、qRT-PCR等方法檢測鉛暴露對細胞CTR1、ATP7A等銅轉(zhuǎn)運體表達水平的影響。 5.采用siRNA干涉技術(shù)和抑制劑對細胞進行處理，分別過表達和阻斷銅轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的表達，觀察對細胞內(nèi)銅蓄積量的影響。 6.采用已構(gòu)建的Tet-可誘導CTR1高表達細胞系（iZCTR1），檢測細胞內(nèi)銅水平升高對細胞中銅轉(zhuǎn)運體ATP7A表達水平的影響。 結(jié)果： 1.慢性鉛暴露對大鼠大腦中銅含量和氧化應(yīng)激水平的影響鉛暴露后，與對照組相比，大鼠大腦（海馬、皮質(zhì)、紋狀體、腦脊液）中銅含量顯著升高（p0.01），并且大鼠大腦中氧化應(yīng)激水平增高，表現(xiàn)為T-SOD活力顯著下降，MDA含量顯著增高（p0.01）。 2.慢性鉛暴露對脈絡(luò)叢中銅轉(zhuǎn)運體表達的影響脈絡(luò)叢免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTR1的熒光表達量顯著增多，而ATP7A的表達量是顯著下降的。 3.鉛暴露導致Z310細胞內(nèi)銅蓄積與對照組相比，Z310細胞鉛處理24h后，細胞內(nèi)的銅吸收量顯著增加；細胞銅吸收后，再加入鉛處理24h，鉛處理組細胞中銅的水平顯著高于對照組（p0.01）。 4.鉛、銅暴露對Z310細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響單獨鉛暴露（5μmol/L Pb(AC)2）和銅暴露（5μmol/L CuCl2）24h均引起T-SOD的活力下降，鉛、銅聯(lián)合處理組T-SOD活力下降的幅度均顯著大于鉛或銅單獨暴露組（p0.01）；單獨鉛暴露和銅暴露24h均引起MDA含量增高；鉛、銅聯(lián)合處理組MDA含量增加的幅度均顯著大于鉛或銅單獨暴露組（p0.01）。 5.銅轉(zhuǎn)運體在鉛暴露所致銅蓄積中的作用與對照相比，鉛暴露后，， CTR1的表達水平增高，ATP7A的表達水平下降，并具有劑量依賴性。CTR1siRNA干涉可以顯著抑制Z310細胞對銅的吸收，并且阻斷了鉛誘導的細胞銅吸收增加；ATP7AsiRNA干涉可以顯著抑制Z310細胞對銅的排出（p0.01）。 6.細胞內(nèi)銅含量對銅轉(zhuǎn)運體的反饋調(diào)節(jié)Z310細胞不同濃度（5，25和50μmol/L CuCl2）銅暴露24h后，細胞內(nèi)銅水平增高，CTR1的蛋白水平有明顯下降，而mRNA水平?jīng)]有明顯改變；ATP7A的蛋白水平和mRNA水平都沒有明顯變化。在iZCTR1細胞中，銅處理的細胞內(nèi)銅蓄積對ATP7A的表達水平并未產(chǎn)生顯著影響，而鉛處理可導致細胞中 ATP7A的表達水平出現(xiàn)顯著降低（p0.01）。結(jié)論： 1.鉛暴露可導致動物大腦組織和Z310細胞中銅水平的增高，而銅離子平衡的紊亂可能導致氧化應(yīng)激反應(yīng)的增強。 2.鉛暴露導致的細胞中銅蓄積可能是通過兩種途徑：一是鉛暴露上調(diào)CTR1表達，吸收更多的銅進入細胞；二是鉛暴露下調(diào)ATP7A表達，抑制了銅的運輸功能，引起細胞中銅流出的減少。 3.細胞內(nèi)銅水平的增加對CTR1的表達產(chǎn)生負反饋，對ATP7A的表達未產(chǎn)生顯著影響。
[Abstract]:Lead is a common heavy metal pollutant in the environment , and has remarkable neurotoxicity . In recent years , it has been proved that lead plays an important role in the development of some neurodegenerative diseases ( such as PD , AD , etc . ) . Its mechanism may be related to inducing cell oxidative stress , disturbing neurotransmitter release and its receptor expression and function , disrupting cell energy metabolism , etc .

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本文編號：2128091