本文關(guān)鍵詞：新型-N型鈣離子通道抑制劑的發(fā)現(xiàn)、優(yōu)化及作用機(jī)制研究

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【摘要】：芋螺屬軟體動(dòng)物(芋螺,Conus),廣泛分布于熱帶海域,全世界約有750種。在我國南海及臺(tái)灣海峽,已發(fā)現(xiàn)70余種。根據(jù)食性,可將芋螺分為食魚類(Piscivorous)、食蟲類(Vermivorous)及食軟體動(dòng)物類(Molluscivorous)。芋螺毒素(Conotoxins,或芋螺多肽(Conopeptides))由芋螺毒腺及毒腺管分泌,組成復(fù)雜,每種芋螺的毒液可存在超過100種不同的芋螺多肽。目前已發(fā)現(xiàn)芋螺多肽對(duì)多種重要的分子靶標(biāo)具有高結(jié)合活性及選擇性,包括鈉、鉀、鈣等離子通道,煙堿型乙酰膽堿受體,谷氨酸能受體等多種神經(jīng)遞質(zhì)受體,G蛋白偶聯(lián)受體等。由于上述特性,芋螺多肽可以作為神經(jīng)生物學(xué)的研究工具,也可直接發(fā)展成藥物。鈣離子通道廣泛存在于哺乳動(dòng)物的可興奮細(xì)胞中,調(diào)節(jié)Ca2+電流,參與許多重要的生理過程,如肌肉的興奮-收縮偶聯(lián)過程、激素的分泌與調(diào)控、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、傷害性疼痛傳導(dǎo)等。N-型電壓門控鈣離子通道(Neural Voltage-gated Calcium Channel,N-VGCC,CaV2.2)屬于高壓激活鈣離子通道,主要分布在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的突觸前神經(jīng)末梢,在神經(jīng)遞質(zhì)(如:谷氨酸、P物質(zhì)、CGRP等)的釋放過程中起關(guān)鍵作用,是治療病理性慢性疼痛、炎癥疼痛的重要靶點(diǎn)。目前已發(fā)現(xiàn)一系列ω-芋螺多肽可抑制CaV2.2活性。ω-MVIIA(Ziconotide)已于2004年由美國FDA批準(zhǔn)上市,適用于頑固性非癌癥疼、癌癥疼及艾滋病相關(guān)疼,該藥治療窗狹窄,僅能鞘內(nèi)給藥,且存在較嚴(yán)重的副作用。之后發(fā)現(xiàn)的ω-CVID(Leconotide)比ω-MVIIA的副作用小,靜脈給藥ω-CVID可緩解痛覺增敏,但未見后續(xù)臨床試驗(yàn)報(bào)導(dǎo)。ω-CVIE和ω-CVIF是最近發(fā)現(xiàn)的CaV2.2抑制劑,能可逆地抑制初級(jí)傳入神經(jīng)到脊髓背角淺層神經(jīng)元的興奮性突觸傳遞。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的ω-芋螺多肽SO-3對(duì)CaV2.2有很強(qiáng)的抑制活性和選擇性,鎮(zhèn)痛作用與ω-MVIIA相當(dāng),但毒副作用較低,目前已完成臨床前試驗(yàn)。?-芋螺多肽是目前已知的最小的一類芋螺多肽,通常僅含有12-19個(gè)氨基酸殘基,其中包括兩對(duì)二硫鍵,二硫鍵的連接方式通常是Cys1-Cys3,Cys2-Cys4。大部分?-芋螺多肽作用于煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR),最近發(fā)現(xiàn)一類?-芋螺多肽,如AuIB、RgIA、Vc1.1、Pe IA,也具有CaV2.2抑制活性。此類芋螺多肽可在胞外與γ-氨基丁酸B型受體(GABABR)結(jié)合,使GABABR的胞內(nèi)部分釋放G蛋白G?γ亞基。G?γ亞基可與CaV2.2的α1亞基相互作用,減弱CaV2.2的激活電流及去活化電流。此類芋螺多肽中,Vc1.1在動(dòng)物模型中表現(xiàn)出良好的鎮(zhèn)痛作用,但在臨床II期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)對(duì)人的親和力較差,由于藥效不佳而中止臨床試驗(yàn)。環(huán)化的Vc1.1可以口服給藥,且仍有鎮(zhèn)痛效果。該類多肽因序列短、易合成、毒性低、給藥方式簡便,具有很高的藥用前景。本課題組前期除發(fā)現(xiàn)特異作用于cav2.2的ω-芋螺多肽so-3外,還開展了?-芋螺多肽的發(fā)現(xiàn)、合成、靶點(diǎn)鑒定及藥物發(fā)展研究。應(yīng)用基因克隆方法,獲得了一系列新?-芋螺多肽序列。在中國南海芋螺黑星芋螺(conusebraeus)、小牛芋螺(conusvitulinus)中發(fā)現(xiàn)的eb1.6及vt1.27,分別含16及17個(gè)氨基酸,均含兩對(duì)二硫鍵。前期澳大利亞合作實(shí)驗(yàn)室的靶點(diǎn)研究表明,該兩種芋螺多肽對(duì)cav2.2的ica均有一定抑制效果,這是首次發(fā)現(xiàn)?-芋螺多肽可直接作用于cav2.2。本論文在前期初步工作基礎(chǔ)上,開展該兩個(gè)芋螺多肽cav2.2的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系研究,并將ω-芋螺多肽so-3、mviia的關(guān)鍵作用區(qū)域引入eb1.6及vt1.27,設(shè)計(jì)合成嵌合肽,以探索獲得新的cav2.2抑制劑,為研發(fā)序列短、活性高、毒性低的新型cav2.2抑制劑奠定基礎(chǔ)。本論文的主要研究結(jié)果如下:(1)成功建立了全細(xì)胞膜片鉗測定cav2.2的技術(shù)平臺(tái)。擴(kuò)增了cav2.2及其輔助亞基的質(zhì)粒,成功的在hek293細(xì)胞中功能表達(dá)cav2.2通道,完成了全細(xì)胞膜片鉗設(shè)備的調(diào)試及cav2.2通道抑制活性測定方法的建立。(2)芋螺多肽eb1.6及突變體對(duì)cav2.2抑制活性較低。10μm濃度的eb1.6對(duì)cav2.2的抑制活性為28.96±8.84%。參照vt1.27對(duì)pro13、asn14進(jìn)行改造后,10μm濃度的突變體抑制活性下降。pro13被asn或gln取代后,eb1.6[p13n]及eb.16[p13q]的抑制活性分別為10.87±2.37%及13.32±3.16%。asn14突變?yōu)閹ж?fù)電荷的asp或glu,eb1.6[n14d]及eb1.6[n14e]的抑制活性分別為3.37±2.61%及5.80±1.89%。asn14被疏水性氨基酸phe或leu替代后活性亦下降,eb1.6[n14f]及eb1.6[n14l]的抑制活性分別為14.09±2.96%及15.93±4.49%。該工作表明pro13和asn14是eb1.6與cav2.2作用的關(guān)鍵氨基酸。(3)芋螺多肽vt1.27對(duì)cav2.2的抑制活性略高于eb1.6,10μm抑制率為34.52±9.45%。his6被ala或pro取代、ile10被asn取代后,活性變化不明顯,如vt1.27[h6a]、vt1.27[h6p,p9a]及vt1.27[i10n]的抑制活性分別為32.01±8.29%、30.33±6.03%及29.01±4.68%。其余突變體的抑制活性降低,如vt1.27[d11a]、vt1.27[y12a]、vt1.27[r14a]、vt1.27[f15a]、vt1.27[i10d,d11i]等,對(duì)cav2.2的抑制活性在11.20±2.76%~24.19±8.29%之間。上述結(jié)果表明asp11,tyr12及arg14是vt1.27與cav2.2作用的關(guān)鍵氨基酸。(4)基于分子計(jì)算,以so-3或mviialoop2區(qū)取代eb1.6、vt1.27的loop2區(qū),并結(jié)合so-3的n-端及c-端堿性序列,共設(shè)計(jì)合成了11個(gè)eb1.6、vt1.27與so-3或mviia的嵌合肽。其中,2個(gè)eb1.6嵌合肽(10μm)的抑制活性分別為14.46±5.46%、7.45±4.69%,活性低于eb1.6。9個(gè)vt1.27嵌合肽(10μm)的抑制活性為18.74±4.24%~36.86±6.72%。將vt1.27的met4替換為lys,his6替換為arg,并以mviialoop2區(qū)取代vt1.27原有l(wèi)oop2,且在loop2尾部增加一個(gè)Gly后的嵌合肽具有最好的活性,抑制活性為36.86±6.72%。但單獨(dú)用MVIIA或SO-3的loop2替換Vt1.27的loop2后活性下降,說明兩者不能完全互換,然而該loop2稍增長可改善對(duì)CaV2.2的抑制活性。
【關(guān)鍵詞】：α-芋螺多肽 N-型電壓門控鈣離子通道 抑制劑 結(jié)構(gòu)活性關(guān)系 嵌合肽
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78;R91;R914.5
【目錄】：

• 縮略詞表6-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-14
• 第一章 前言14-23
• 1.1 引言14
• 1.2 電壓依賴的鈣通道分類及功能14-15
• 1.3 CaV2.2 的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)15-18
• 1.3.1 CaV2.2 a1 亞基的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)15-16
• 1.3.2 CaV2.2 輔助亞基的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)16-17
• 1.3.3 CaV2.2 的生理學(xué)及病理生理學(xué)功能17-18
• 1.4 CaV2.2 抑制劑18-22
• 1.4.1 芋螺多肽類CaV2.2 抑制劑18-19
• 1.4.2 其他動(dòng)物毒素類CaV2.2 抑制劑19-20
• 1.4.3 小分子類CaV2.2 抑制劑20-22
• 1.5 本課題的研究內(nèi)容、目的及意義22-23
• 第二章 Eb1.6 的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系研究23-37
• 2.1 引言23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器與耗材23-26
• 2.2.1 主要儀器23-24
• 2.2.2 材料及試劑24-26
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法26-30
• 2.3.1 芋螺多肽制備26-27
• 2.3.2 膜片鉗方法測定多肽對(duì)鈣離子通道的抑制活性27-30
• 2.3.3 分子對(duì)接模擬30
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-35
• 2.4.1 Eb1.6 及其突變體的合成、折疊、富集及純化30-33
• 2.4.2 Eb1.6 及其突變體對(duì)CaV2.2 的抑制活性33-35
• 2.5 討論35-36
• 2.5.1 Eb1.6 及其突變體的制備35
• 2.5.2 Eb1.6 的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系35-36
• 2.5.3 測定方法對(duì)抑制活性結(jié)果的影響36
• 2.6 小結(jié)36-37
• 第三章 Vt1.27的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系研究37-44
• 3.1 引言37
• 3.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器與耗材37
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法37-38
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-42
• 3.4.1 Vt1.27及其突變體的合成、折疊、富集及純化38-40
• 3.4.2 Vt1.27及其突變體對(duì)CaV2.2 的抑制活性40-42
• 3.5 討論42-43
• 3.5.1 Vt1.27及其突變體的制備42
• 3.5.2 Vt1.27的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系42-43
• 3.5.3 Vt1.27及其突變體與CaV2.2 相互作用模式43
• 3.6 小結(jié)43-44
• 第四章 作用于CaV2.2 的嵌合肽設(shè)計(jì)、合成及活性測定44-54
• 4.1 引言44-45
• 4.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器與耗材45
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法45
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-51
• 4.4.1 兩類嵌合肽的合成、折疊、富集及純化45-47
• 4.4.2 第一類嵌合肽對(duì)CaV2.2 的抑制活性47-49
• 4.4.3 第二類及其他嵌合肽對(duì)CaV2.2 抑制活性49-51
• 4.5 討論51-53
• 4.5.1 嵌合肽的制備51-52
• 4.5.2 嵌合肽抑制活性比較52
• 4.5.3 嵌合肽與CaV2.2 相互作用模式52-53
• 4.6 小結(jié)53-54
• 第五章 總結(jié)54-56
• 參考文獻(xiàn)56-64
• 附錄I 本論文涉及多肽的HPLC/MS分析圖譜64-73
• 附錄II 主要溶液配制73-74
• 附錄III 新發(fā)現(xiàn)芋螺多肽對(duì)CaV2.2 抑制活性的篩選74-79
• 1. 引言74
• 2. 主要實(shí)驗(yàn)儀器及耗材74
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法74
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果74-79
• 個(gè)人簡歷79-80
• 致謝80

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本文編號(hào)：993390