本文關(guān)鍵詞：黃豆苷類藥物DZ18抗血小板聚集作用及機(jī)制研究

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【摘要】：血栓性疾病是一類嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。血小板在血栓形成過程中發(fā)揮了重要作用,因此,研發(fā)抗血小板藥物對血栓性疾病的預(yù)防和治療有著十分重要的意義。血小板膜上有多種受體,在誘導(dǎo)劑的刺激下,血小板會從靜息狀態(tài)激活為活化狀態(tài),血小板形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,并通過纖維蛋白原相互連接、黏附成團(tuán),導(dǎo)致血栓的形成。由于血小板的活化在血栓形成中發(fā)揮了主要作用,因此抗血小板治療是臨床上預(yù)防和治療血栓性疾病的主要手段。DZ18是一種全新的黃豆苷類化合物。實驗室前期研究結(jié)果表明,在體內(nèi)試驗中,DZ18在不同類型血小板聚集模型上,均表現(xiàn)出明顯劑量依賴性抗血栓形成作用。本研究主要觀察了DZ18在體外對不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制作用,并研究其作用機(jī)制,以期尋找其作用靶點。實驗結(jié)果顯示：(1)體外試驗中,DZ18劑量依賴性地抑制二磷酸腺苷(ADP)、膠原(COLL)、U46619(血栓烷A2類似物)引起的血小板聚集,提示其可能是一種多靶點、廣譜抗血小板藥,為了探討其可能的作用機(jī)制及作用靶點,我們又研究了DZ18對三種誘導(dǎo)劑作用的信號通路的影響。(2)ADP在血小板膜上有兩種G蛋白受體：P2Y1和P2Y12。P2Y1偶聯(lián)Gq蛋白,激活磷脂酶C(PLC),水解PIP2產(chǎn)生IP3,IP3開啟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子通道,增加胞漿內(nèi)鈣離子濃度,引起血小板聚集；P2Y12偶聯(lián)Gi蛋白,抑制腺苷酸環(huán)化酶(AC)活性,降低cAMP含量,引起血小板聚集。本研究結(jié)果顯示,DZ18在與P2Y1受體拮抗劑MRS2179、P2Y12受體拮抗劑MRS2395聯(lián)合給藥時,表現(xiàn)出顯著的協(xié)同拮抗作用；同時,DZ18明顯逆轉(zhuǎn)了ADP引起的磷脂酶C磷酸化水平下降；DZ18明顯抑制了ADP引起的IP1含量升高,但對PLC激動劑引起的IP1含量升高則無明顯影響。以上結(jié)果表明,DZ18可能作用于P2Y1-PLC信號通路,抑制ADP引起的血小板聚集。(3)PGE1可使血小板中cAMP含量升高,ADP結(jié)合P2Y12受體,降低cAMP含量,研究結(jié)果顯示,DZ18則明顯逆轉(zhuǎn)ADP引起的cAMP含量下降；單獨(dú)給予DZ18時,cAMP含量同樣有顯著升高,提示DZ18可能通過升高cAMP含量抑制血小板聚集。(4)花生四烯酸在環(huán)氧化酶作用下生成PGI2和TXA2,PGI2和TXA2的平衡失調(diào)是造成血小板聚集,血管痙攣收縮、血栓形成的原因之一。本研究檢測了DZ18對大鼠血小板PGI2和TXA2含量的影響。結(jié)果顯示,AA刺激后TXA2含量明顯上升,同時PGI2含量明顯下降,而DZ18對PGI2和TXA2含量變化無明顯影響,提示DZ18可能并非通過環(huán)氧化酶通路抑制血小板聚集。(5)糖蛋白GPⅡbⅢa是血小板活化的最終共同通路,血小板通過GPⅡbⅢa受體位點相互連接、黏附成團(tuán)。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示,誘導(dǎo)劑刺激后,GPⅡbⅢa陽性率有明顯上升,而DZ18對GPⅡbⅢa陽性率上升沒有抑制作用,表明DZ18可能不通過競爭性結(jié)合GPⅡbⅢa受體位點抑制血小板聚集；同時我們觀察了DZ18對血小板活化功能的影響,結(jié)果顯示,DZ18顯著降低了刺激后血小板表面CD62p的表達(dá),抑制了血小板活化。綜合上述結(jié)果,我們得到如下結(jié)論：DZ18可顯著抑制了多種誘導(dǎo)劑引起的血小板聚集、活化；DZ18可能通過拮抗P2Y1受體,抑制PLC活性,降低胞漿內(nèi)鈣離子濃度,抑制ADP引起的血小板聚集；同時DZ18通過升高胞漿內(nèi)cAMP含量,從而達(dá)到抑制血小板聚集的作用。
【關(guān)鍵詞】：DZ18 抗血小板藥 信號通路
【學(xué)位授予單位】：信陽師范學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 縮略詞表11-12
• 第1章 引言12-17
• 1.1 血栓的形成12
• 1.2 血小板在血栓形成中的作用12-13
• 1.3 抗血小板藥分類13-15
• 1.3.1 環(huán)氧化酶(COX)抑制劑13-14
• 1.3.2 二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)受體拮抗劑14
• 1.3.3 磷酸二酯酶(Phosphodiesterase,PDE)抑制劑14-15
• 1.3.4 糖蛋白ⅡbⅢa(GPⅡb/Ⅲa)受體拮抗劑15
• 1.4 研究思路15-17
• 第2章 材料與方法17-27
• 2.1 實驗材料17-19
• 2.1.1 實驗動物17
• 2.1.2 試劑和藥品17-18
• 2.1.3 儀器18
• 2.1.4 溶液配制18-19
• 2.2 實驗方法19-26
• 2.2.1 富血小板血漿(platelet rich plasma,PRP)和貧血小板血漿(platelet poorplasma,PPP)的制備19-20
• 2.2.2 比濁法測定血小板聚集率20
• 2.2.3 全血法流式細(xì)胞術(shù)檢測CD41/CD61、CD62p表達(dá)20-21
• 2.2.4 Western blot實驗21-22
• 2.2.5 IP_1含量測定22-23
• 2.2.6 ELISA檢測cAMP含量23-24
• 2.2.7 TXB2含量測定24-25
• 2.2.8 6-keto-PGF_(1α)含量測定25-26
• 2.3 結(jié)果統(tǒng)計26-27
• 第3章 實驗結(jié)果27-43
• 3.1 DZ18對大鼠血小板聚集的抑制作用27-30
• 3.1.1 DZ18對ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集的抑制作用27-28
• 3.1.2 DZ18對U46619誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集的抑制作用28
• 3.1.3 DZ18對COLL誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集的抑制作用28-29
• 3.1.4 小結(jié)29-30
• 3.2 DZ18對血小板活化及GPⅡb/Ⅲa信號通路的影響30-31
• 3.2.1 DZ18對血小板活化的影響30-31
• 3.2.2 DZ18對GPⅡb/Ⅲa信號通路的影響31
• 3.3 DZ18對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集信號通路的作用31-38
• 3.3.1 DZ18與P2Y_1受體拮抗劑合用對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的作用32-33
• 3.3.2 DZ18與P2Y_(12)受體拮抗劑合用對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的作用33-34
• 3.3.3 DZ18對磷脂酶C(PLC)和磷酸化磷脂酶C(p-PLC)表達(dá)的影響34-35
• 3.3.4 DZ18對IP_1含量的影響35-36
• 3.3.5 DZ18對cAMP含量的影響36-38
• 3.3.6 小結(jié)38
• 3.4 DZ18對血栓素A_2信號通路的作用38-39
• 3.5 討論39-43
• 第4章 結(jié)論43-44
• 致謝44-45
• 參考文獻(xiàn)45-50
• 攻讀學(xué)位期間獲得與學(xué)位論文相關(guān)的科研成果50

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