本文關(guān)鍵詞：海綿來(lái)源Stellettin B的抗腫瘤作用及機(jī)理研究

  更多相關(guān)文章： Stel B A549 SF295 周期阻滯 凋亡 自噬 PI3K/Akt 通路

【摘要】：目的:本文旨在探討海綿來(lái)源化合物Stellettin B(Stel B)對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的抗腫瘤作用及分子機(jī)理,并在前期工作的基礎(chǔ)上研究了對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤SF295細(xì)胞自噬的影響,為該類(lèi)化合物開(kāi)發(fā)成抗腫瘤藥物提供初步的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:1.利用WST-8實(shí)驗(yàn)研究Stel B對(duì)A549細(xì)胞和SF295細(xì)胞的增殖抑制活性。2.利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Stel B對(duì)A549細(xì)胞周期的影響;利用Western blot方法研究Stel B對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、Rb和p27的表達(dá)或磷酸化水平的影響。3.利用流式細(xì)胞術(shù)及DAPI染色法評(píng)價(jià)Stel B是否具有誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的作用;利用Western blot方法研究Stel B對(duì)A549細(xì)胞中PARP剪切片段表達(dá)水平的影響。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Stel B對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的影響。4.利用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括MDC染色、透射電子顯微鏡、Western blot以及m RFP-GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染評(píng)價(jià)Stel B是否具有誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬的作用。5.利用Western blot方法研究Stel B對(duì)A549和SF295細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路中相關(guān)分子表達(dá)或磷酸化的影響。6.利用WST-8法檢測(cè)應(yīng)用自噬抑制劑氯喹抑制自噬作用后Stel B抗腫瘤活性的變化。結(jié)果:1.Stel B可顯著抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖,且抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性,IC50值為0.022μM。2.Stel B處理后A549細(xì)胞周期停滯在G1期,細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1表達(dá)下降,p27表達(dá)升高,Rb的磷酸化水平降低。3.Stel B處理后熒光倒置顯微鏡檢測(cè)可觀察到A549細(xì)胞內(nèi)核染色質(zhì)固縮,出現(xiàn)核碎片及凋亡小體,并且凋亡程度呈劑量依賴(lài)性;Stel B可使A549細(xì)胞中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白PARP的裂解片段增加;ROS水平增加。4.MDC染色顯示,Stel B作用后A549細(xì)胞核附近亮綠色點(diǎn)狀熒光數(shù)量增加,熒光強(qiáng)度增強(qiáng);自噬標(biāo)志性蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)量增加;通過(guò)透射電鏡觀察到A549細(xì)胞中出現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體;激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示細(xì)胞從自噬體形成到溶酶體降解的過(guò)程順暢。以上研究結(jié)果說(shuō)明Stel B具有誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生自噬的作用。5.Stel B可顯著抑制SF295細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖,且抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性,IC50值為0.026μM。MDC染色、Western blot分析自噬標(biāo)記物以及激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)共同驗(yàn)證了Stel B同樣具有誘導(dǎo)SF295細(xì)胞發(fā)生自噬的能力(我們關(guān)于Stel B對(duì)SF295細(xì)胞周期和凋亡的作用研究已有論文發(fā)表)。6.Stel B可明顯降低A549細(xì)胞中PI3K-p110的表達(dá)及PI3K下游Akt、m TOR和p70S6K等蛋白的磷酸化水平;Stel B對(duì)SF295細(xì)胞中PI3K-p110的蛋白表達(dá)及Akt的磷酸化水平也有抑制作用。7.利用自噬抑制劑氯喹阻斷自噬后,Stel B對(duì)A549和SF295細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)。結(jié)論:1.Stel B在較低濃度下能夠顯著抑制A549和SF295細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖,顯示出較強(qiáng)的體外抗腫瘤活性。2.Stel B具有同時(shí)誘導(dǎo)A549細(xì)胞G1期阻滯、凋亡以及自噬的多方面活性。細(xì)胞周期停滯可歸因于Stel B對(duì)Rb磷酸化水平和cyclin D1表達(dá)水平的下調(diào),以及p27表達(dá)水平的上調(diào)。Stel B的誘導(dǎo)凋亡作用可能與增加A549細(xì)胞內(nèi)活性氧水平以及PARP的裂解有關(guān)。機(jī)制研究表明Stel B通過(guò)阻斷PI3K/Akt通路使A549細(xì)胞發(fā)生周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而抑制其生長(zhǎng)增殖。3.Stel B可誘導(dǎo)SF295細(xì)胞發(fā)生自噬,但SF295細(xì)胞發(fā)生自噬的程度低于A549細(xì)胞。利用自噬抑制劑氯喹聯(lián)合干預(yù)后兩種細(xì)胞存活率降低,提示自噬可能對(duì)A549和SF295細(xì)胞起保護(hù)作用。4.Stel B誘導(dǎo)的自噬作用由PI3K/Akt信號(hào)通路所介導(dǎo),其引起周期停滯、凋亡和自噬的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：Stel B A549 SF295 周期阻滯 凋亡 自噬 PI3K/Akt 通路
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R96
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語(yǔ)11-13
• 前言13-16
• 研究現(xiàn)狀、成果13-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、Stel B對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的抑制作用及機(jī)理研究16-42
• 1.1 對(duì)象和方法16-29
• 1.1.1 細(xì)胞系16
• 1.1.2 主要試劑和藥品16-17
• 1.1.3 主要儀器設(shè)備17
• 1.1.4 實(shí)驗(yàn)方法17-29
• 1.2 結(jié)果29-39
• 1.2.1 Stel B對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用29-30
• 1.2.2 Stel B對(duì)A549細(xì)胞周期的調(diào)控作用30-32
• 1.2.3 Stel B對(duì)A549細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用32-34
• 1.2.4 Stel B對(duì)A549細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用34-37
• 1.2.5 Stel B與CQ共同干預(yù)對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響37-38
• 1.2.6 Stel B對(duì)A549細(xì)胞中PI3K/Akt通路及下游信號(hào)分子的影響38-39
• 1.3 討論39-41
• 1.4 小結(jié)41-42
• 二、Stel B誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤SF295細(xì)胞自噬的作用及機(jī)理研究42-50
• 2.1 對(duì)象和方法42-44
• 2.1.1 細(xì)胞系42
• 2.1.2 主要試劑和藥品42-43
• 2.1.3 主要設(shè)備儀器43
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)方法43-44
• 2.2 結(jié)果44-48
• 2.2.1 Stel B對(duì)SF295細(xì)胞的增殖抑制作用44-45
• 2.2.2 Stel B誘導(dǎo)SF295細(xì)胞產(chǎn)生自噬泡45
• 2.2.3 Stel B對(duì)SF295細(xì)胞自噬過(guò)程的影響45-46
• 2.2.4 Stel B對(duì)SF295細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響46-47
• 2.2.5 Stel B與CQ共同干預(yù)對(duì)SF295細(xì)胞增殖的影響47-48
• 2.2.6 Stel B對(duì)SF295細(xì)胞PI3K/AKT通路的影響48
• 2.3 討論48-49
• 2.4 小結(jié)49-50
• 結(jié)論50-52
• 參考文獻(xiàn)52-55
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明55-56
• 綜述 海洋抗腫瘤藥物的研究進(jìn)展56-67
• 綜述參考文獻(xiàn)63-67
• 致謝67-68
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷68

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