發(fā)布時間：2017-09-29 15:04

  本文關鍵詞：海綿來源Stellettin B的抗腫瘤作用及機理研究

  更多相關文章： Stel B A549 SF295 周期阻滯 凋亡 自噬 PI3K/Akt 通路

【摘要】：目的:本文旨在探討海綿來源化合物Stellettin B(Stel B)對人非小細胞肺癌A549細胞的抗腫瘤作用及分子機理,并在前期工作的基礎上研究了對神經膠質瘤SF295細胞自噬的影響,為該類化合物開發(fā)成抗腫瘤藥物提供初步的理論依據(jù)和實驗基礎。方法:1.利用WST-8實驗研究Stel B對A549細胞和SF295細胞的增殖抑制活性。2.利用流式細胞儀檢測Stel B對A549細胞周期的影響;利用Western blot方法研究Stel B對細胞周期相關蛋白cyclin D1、Rb和p27的表達或磷酸化水平的影響。3.利用流式細胞術及DAPI染色法評價Stel B是否具有誘導A549細胞凋亡的作用;利用Western blot方法研究Stel B對A549細胞中PARP剪切片段表達水平的影響。利用流式細胞儀檢測Stel B對A549細胞內活性氧(ROS)的影響。4.利用多種實驗技術包括MDC染色、透射電子顯微鏡、Western blot以及m RFP-GFP-LC3質粒轉染評價Stel B是否具有誘導細胞發(fā)生自噬的作用。5.利用Western blot方法研究Stel B對A549和SF295細胞中PI3K/Akt信號通路中相關分子表達或磷酸化的影響。6.利用WST-8法檢測應用自噬抑制劑氯喹抑制自噬作用后Stel B抗腫瘤活性的變化。結果:1.Stel B可顯著抑制A549細胞的生長增殖,且抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性,IC50值為0.022μM。2.Stel B處理后A549細胞周期停滯在G1期,細胞周期相關蛋白cyclin D1表達下降,p27表達升高,Rb的磷酸化水平降低。3.Stel B處理后熒光倒置顯微鏡檢測可觀察到A549細胞內核染色質固縮,出現(xiàn)核碎片及凋亡小體,并且凋亡程度呈劑量依賴性;Stel B可使A549細胞中細胞凋亡相關蛋白PARP的裂解片段增加;ROS水平增加。4.MDC染色顯示,Stel B作用后A549細胞核附近亮綠色點狀熒光數(shù)量增加,熒光強度增強;自噬標志性蛋白LC3Ⅱ的表達量增加;通過透射電鏡觀察到A549細胞中出現(xiàn)雙層膜結構的自噬體;激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示細胞從自噬體形成到溶酶體降解的過程順暢。以上研究結果說明Stel B具有誘導A549細胞發(fā)生自噬的作用。5.Stel B可顯著抑制SF295細胞的生長增殖,且抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性,IC50值為0.026μM。MDC染色、Western blot分析自噬標記物以及激光共聚焦顯微鏡檢測共同驗證了Stel B同樣具有誘導SF295細胞發(fā)生自噬的能力(我們關于Stel B對SF295細胞周期和凋亡的作用研究已有論文發(fā)表)。6.Stel B可明顯降低A549細胞中PI3K-p110的表達及PI3K下游Akt、m TOR和p70S6K等蛋白的磷酸化水平;Stel B對SF295細胞中PI3K-p110的蛋白表達及Akt的磷酸化水平也有抑制作用。7.利用自噬抑制劑氯喹阻斷自噬后,Stel B對A549和SF295細胞的抑制作用增強。結論:1.Stel B在較低濃度下能夠顯著抑制A549和SF295細胞的生長增殖,顯示出較強的體外抗腫瘤活性。2.Stel B具有同時誘導A549細胞G1期阻滯、凋亡以及自噬的多方面活性。細胞周期停滯可歸因于Stel B對Rb磷酸化水平和cyclin D1表達水平的下調,以及p27表達水平的上調。Stel B的誘導凋亡作用可能與增加A549細胞內活性氧水平以及PARP的裂解有關。機制研究表明Stel B通過阻斷PI3K/Akt通路使A549細胞發(fā)生周期阻滯和誘導細胞凋亡,從而抑制其生長增殖。3.Stel B可誘導SF295細胞發(fā)生自噬,但SF295細胞發(fā)生自噬的程度低于A549細胞。利用自噬抑制劑氯喹聯(lián)合干預后兩種細胞存活率降低,提示自噬可能對A549和SF295細胞起保護作用。4.Stel B誘導的自噬作用由PI3K/Akt信號通路所介導,其引起周期停滯、凋亡和自噬的關系有待進一步研究。
【關鍵詞】：Stel B A549 SF295 周期阻滯 凋亡 自噬 PI3K/Akt 通路
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語11-13
• 前言13-16
• 研究現(xiàn)狀、成果13-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、Stel B對非小細胞肺癌A549細胞的抑制作用及機理研究16-42
• 1.1 對象和方法16-29
• 1.1.1 細胞系16
• 1.1.2 主要試劑和藥品16-17
• 1.1.3 主要儀器設備17
• 1.1.4 實驗方法17-29
• 1.2 結果29-39
• 1.2.1 Stel B對A549細胞的增殖抑制作用29-30
• 1.2.2 Stel B對A549細胞周期的調控作用30-32
• 1.2.3 Stel B對A549細胞凋亡的調控作用32-34
• 1.2.4 Stel B對A549細胞自噬的誘導作用34-37
• 1.2.5 Stel B與CQ共同干預對A549細胞增殖的影響37-38
• 1.2.6 Stel B對A549細胞中PI3K/Akt通路及下游信號分子的影響38-39
• 1.3 討論39-41
• 1.4 小結41-42
• 二、Stel B誘導神經膠質瘤SF295細胞自噬的作用及機理研究42-50
• 2.1 對象和方法42-44
• 2.1.1 細胞系42
• 2.1.2 主要試劑和藥品42-43
• 2.1.3 主要設備儀器43
• 2.1.4 實驗方法43-44
• 2.2 結果44-48
• 2.2.1 Stel B對SF295細胞的增殖抑制作用44-45
• 2.2.2 Stel B誘導SF295細胞產生自噬泡45
• 2.2.3 Stel B對SF295細胞自噬過程的影響45-46
• 2.2.4 Stel B對SF295細胞自噬相關蛋白表達水平的影響46-47
• 2.2.5 Stel B與CQ共同干預對SF295細胞增殖的影響47-48
• 2.2.6 Stel B對SF295細胞PI3K/AKT通路的影響48
• 2.3 討論48-49
• 2.4 小結49-50
• 結論50-52
• 參考文獻52-55
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明55-56
• 綜述 海洋抗腫瘤藥物的研究進展56-67
• 綜述參考文獻63-67
• 致謝67-68
• 個人簡歷68

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