本文關(guān)鍵詞：Stathmin1基因表達(dá)對(duì)微管藥物抑制細(xì)胞增殖作用的影響

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【摘要】：Stathminl (STMN1)是一種在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中普遍存在的胞質(zhì)可溶性磷蛋白,含有149個(gè)氨基酸,分子量為19KD。在細(xì)胞有絲分裂的不同階段,Stathminl蛋白通過其磷酸化和去磷酸化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變調(diào)節(jié)活性,能夠直接與微管結(jié)合,加速微管解聚和重組裝的過程,或與游離微管蛋白結(jié)合來阻止微管的聚合過程,從而對(duì)細(xì)胞微管動(dòng)態(tài)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要的作用,繼而能夠高效的調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化。繼阿霉素和順鉑后,紫杉醇是最炙手可熱的抗癌藥物,目前研究發(fā)現(xiàn),紫杉醇在多種腫瘤治療中起作用,如卵巢癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌等。紫杉醇藥物作用的靶位點(diǎn)是細(xì)胞骨架的微管系統(tǒng),可以結(jié)合在p-微管蛋白N-端第31位氨基酸及217至231位氨基酸上,結(jié)合后可促進(jìn)微管蛋白聚合并穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu),抑制其解聚,進(jìn)而影響微管聚合與解聚的動(dòng)態(tài)平衡,導(dǎo)致有絲分裂紡錘體形成受阻,從而使微管排列異常而形成穩(wěn)定的非功能性微管束,將細(xì)胞周期阻斷于G2/M期,最終促使細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡。除紫杉醇外,一種新型的抗癌藥物去氧鬼臼毒素(DPPT)最近幾年也引起了研究者的關(guān)注。去氧鬼臼毒素能夠結(jié)合微管蛋白上的秋水仙素位點(diǎn),抑制微管的聚合,從而使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期,起到抗腫瘤的效果。本實(shí)驗(yàn)以正常小鼠的成肌細(xì)胞C2C12為實(shí)驗(yàn)材料,用兩種抗腫瘤藥物紫杉醇和DPPT分別處理C2C12細(xì)胞48h后,對(duì)其進(jìn)行形態(tài)觀察,并通過MTT方法檢測(cè)存活率,分別提取相應(yīng)總蛋白和總RNA,進(jìn)一步對(duì)其在給藥后Stathminl基因以及蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),初步探討了兩種抗腫瘤藥物對(duì)正常細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示,隨著藥物濃度的升高,細(xì)胞的存活率大致呈馬鞍形,即低濃度0.1州和高濃度100州的DPPT藥物處理后細(xì)胞存活率較高,分別為70.6%和97.9%；低濃度0.1州和高濃度100μM的紫杉醇藥物處理后細(xì)胞存活率分別為53.7%和98.7%。只有在一定濃度范圍內(nèi)時(shí),隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞的存活率降低。不同點(diǎn)在于,DPPT藥物在濃度為1州時(shí),細(xì)胞存活率達(dá)到最低值為55.8%；而紫杉醇在藥物濃度為0.51μM時(shí),細(xì)胞存活率達(dá)到最低值為39.1%。在藥效方面,總的來說,DPPT與紫杉醇相比,DPPT處理細(xì)胞時(shí),細(xì)胞的死亡率小于紫杉醇處理細(xì)胞的死亡率；不同濃度的DPPT和紫杉醇分別處理C2C1248h后,通過Western Blot檢測(cè)細(xì)胞STMN1的表達(dá)水平,在藥物濃度為0.5μM時(shí),Stathminl蛋白表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組來說分別降低70.6%和77.9%。隨著藥物濃度增加,Stathminl蛋白表達(dá)水平反而有所增加。細(xì)胞STMN1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)后顯示,在藥物DPPT濃度為0.1μM時(shí),nRNA相對(duì)表達(dá)水平降低了60.6%,在藥物紫杉醇濃度為0.51μM時(shí),mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低了79.9%,之后隨著藥物濃度的增加,STMN1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平出現(xiàn)一定上升趨勢(shì)。綜上所述,紫杉醇和DPPT的抗癌作用與細(xì)胞STMN1表達(dá)水平有著密切的聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)以人肺腺癌細(xì)胞A549為實(shí)驗(yàn)材料,利用RNA干擾技術(shù),成功地構(gòu)建了人Stathmin1 shRNA干擾表達(dá)載體,重組干擾質(zhì)粒分別命名為STMN1/hshRNA1、STMN1/hshRNA2和STMN1/hshRNA3,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人肺腺癌細(xì)胞A549,通過檢測(cè)人Stathmin1 shRNA干擾質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞中Stathmin1表達(dá)水平的下調(diào)作用來計(jì)算出干擾效率,通過轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后的人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞的遷移水平的變化來探討人Stathmin1基因表達(dá)水平與細(xì)胞遷移的相關(guān)性。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,STMN1/hshRNA1和STMN1/hshRNA3干擾質(zhì)粒使A549細(xì)胞中Stathmin1蛋白表達(dá)水平分別降低了82.2%和78.4%,RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,STMN1 mRNA的表達(dá)水平分別降低了59.1%和54.7%。由此可知,STMN1/hshRNA1和STMN1/hshRNA3干擾質(zhì)粒的構(gòu)建,能有效干擾Stathmin1的表達(dá)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相比于轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒的A549細(xì)胞的遷移率,轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒STMN1/hshRNA1的細(xì)胞遷移率在8h和16h時(shí)分別顯著降低了63.2%和55.8%,轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒STMN1/hshRNA3分別顯著降低了72.2%和62.4%。由此說明,STMN1的表達(dá)水平的降低,可以明顯降低人肺腺癌細(xì)胞A549的遷移率。本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步探討了Stathmin1干擾和藥物聯(lián)合作用對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果數(shù)據(jù)表示,0.5μM紫杉醇和去氧鬼臼毒素作用A549細(xì)胞時(shí)細(xì)胞存活率分別為28.5%和45.8%,然而STMN1/hshRNA1干擾與0.5μM紫杉醇、DPPT聯(lián)合作用A549細(xì)胞時(shí),細(xì)胞存活率降低至21.2%和32.4%；STMN1/hshRNA3干擾與0.5μM紫杉醇、DPPT聯(lián)合作用A549細(xì)胞時(shí),細(xì)胞存活率降低至27.2%和31.7%,因此,聯(lián)合作用可以降低腫瘤藥物的用量。
【關(guān)鍵詞】：Stathmin1 紫杉醇 去氧鬼臼毒素 RNA干擾
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一章 綜述11-19
• 第一節(jié) 紫杉醇和DPPT(去氧鬼臼毒素)兩種藥物與微管的關(guān)系11-14
• 1.1 紫杉醇與微管組裝的關(guān)系11-12
• 1.2 DPPT(去氧鬼臼毒素)與微管組裝的關(guān)系12-14
• 第二節(jié) Stathmin1基因及其功能14-17
• 2.1 Stathmin1基因14
• 2.2 Stathmin1蛋白14
• 2.3 Stathmin1蛋白與細(xì)胞周期14-15
• 2.4 Stathmin1蛋白與腫瘤15
• 2.5 Stathmin1蛋白與腫瘤生物治療15-16
• 2.6 Stathmin1蛋白在腫瘤生物治療中的研究現(xiàn)狀16-17
• 第三節(jié) RNA干擾技術(shù)的研究進(jìn)展17-18
• 第四節(jié) Stathmin1 shRNA干擾和藥物聯(lián)合處理效果的研究18-19
• 第二章 DPPT(去氧鬼臼毒素)藥物對(duì)C2C12細(xì)胞Stathmin1表達(dá)水平的影響19-38
• 2.1 前言19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料19-21
• 2.2.1 主要儀器19-20
• 2.2.2 主要試劑和耗材20
• 2.2.3 主要溶劑配制20-21
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法21-26
• 2.3.1 兩種藥物處理正常小鼠成肌細(xì)胞C2C12后觀察細(xì)胞形態(tài)的變化21-22
• 2.3.2 兩種藥物處理正常小鼠成肌細(xì)胞C2C12后測(cè)定細(xì)胞存活率22
• 2.3.3 兩種藥物處理正常小鼠成肌細(xì)胞C2C12后總蛋白提取22-23
• 2.3.4 兩種藥物處理正常小鼠成肌細(xì)胞C2C12后總RNA提取23-24
• 2.3.5 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)24-25
• 2.3.6 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)25-26
• 2.3.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)26
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-35
• 2.4.1 DPPT藥物處理對(duì)正常小鼠成肌細(xì)胞C2C12形態(tài)的影響26-27
• 2.4.2 紫杉醇藥物處理對(duì)正常小鼠成肌細(xì)胞C2C12形態(tài)的影響27-28
• 2.4.3 兩種藥物處理對(duì)正常小鼠成肌細(xì)胞C2C12存活率的影響28-29
• 2.4.4 兩種藥物處理對(duì)正常小鼠成肌細(xì)胞C2C12 Stathminl的表達(dá)水平影響29-31
• 2.4.5 低濃度紫杉醇(0.1×)誘導(dǎo)小鼠成肌細(xì)胞系C2C12分化31-33
• 2.4.6 Stathmin1 shRNA干擾質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)染小鼠成肌細(xì)胞系C2C12檢測(cè)干擾效率33-35
• 2.5 討論35-38
• 第三章 人Stathmin1基因干擾對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549遷移的影響38-56
• 3.1 前言38
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料38-40
• 3.2.1 主要儀器38-39
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞39
• 3.2.3 主要耗材和試劑39
• 3.2.4 主要溶液配制39-40
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法40-45
• 3.3.1 人Stathmin1 shRNA載體的構(gòu)建40-43
• 3.3.2 人Stathmin1 shRNA干擾效率的鑒定43-44
• 3.3.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人Stathmin1 shRNA對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549遷移的影響44
• 3.3.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)44-45
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-53
• 3.4.1 選取合適的RNA干擾片段并且設(shè)計(jì)shRNA的引物序列45
• 3.4.2 人Stathmin1 shRNA載體的構(gòu)建及建立45-47
• 3.4.3 人Stathmin1 shRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549檢測(cè)干擾效率47-49
• 3.4.4 人Stathmin1 shRNA對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549遷移的影響49-51
• 3.4.5 人Stathmin1 shRNA干擾質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)染SGC7901檢測(cè)干擾效率51-53
• 3.5 討論53-56
• 第四章 Stathmin1基因干擾與藥物聯(lián)合作用對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549的影響56-61
• 4.1 前言56
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料56-57
• 4.2.1 主要儀器56
• 4.2.2 主要試劑和耗材56-57
• 4.2.3 主要溶液配制57
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法57-58
• 4.3.1 人肺腺癌細(xì)胞A549的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染57
• 4.3.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率57-58
• 4.3.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)58
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果58-60
• 4.4.1 Stathmin1干擾與藥物聯(lián)合作用對(duì)A549及SGC7901細(xì)胞存活率影響58-60
• 4.5 討論60-61
• 全文總結(jié)61-62
• 本研究主要結(jié)論61
• 存在問題與后續(xù)研究打算61-62
• 參考文獻(xiàn)62-67
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文67-68
• 致謝68

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1 朱雄;吳葆金;羅厚蔚;陶磊;趙卿;郭青龍;吳暢p，

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