本文關(guān)鍵詞：胞內(nèi)微環(huán)境觸發(fā)pH氧化還原雙敏感釋藥PAMAM靶向遞藥系統(tǒng)的研究

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【摘要】：目的:本研究旨在構(gòu)建集長(zhǎng)循環(huán)、主動(dòng)靶向、pH氧化還原雙敏感、溶酶體逃逸等多功能于一體的高效、智能抗腫瘤遞藥系統(tǒng),以期實(shí)現(xiàn)抗腫瘤藥物在腫瘤靶細(xì)胞內(nèi)的有效遞送及快速釋放。同時(shí),對(duì)所制備的復(fù)合物遞藥系統(tǒng)的體內(nèi)外抗腫瘤效果及機(jī)制進(jìn)行考察與探討。方法:首先,以4代的聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子(PAMAM)為聚合物骨架材料,通過(guò)酰胺反應(yīng)在其表面引入組氨酸(His),并控制PAMAM和His的反應(yīng)投料比(1:8、1:16和1:32),合成三種不同His修飾程度的PAMAM-His(PH)載體;采用物理包埋的方式將抗腫瘤模型藥物阿霉素(DOX)包載在PAMAM-His的疏水空腔內(nèi)制備一系列載藥復(fù)合物,通過(guò)體外釋放、細(xì)胞毒性和細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)等篩選最佳的His和PAMAM投料比。然后,聚乙二醇(PEG)通過(guò)二硫鍵將連接在PAMAM的表面,合成PSSPH聚合物;為了進(jìn)一步提高PSSPH聚合物的主動(dòng)靶向作用,增強(qiáng)其抗腫瘤活性,采用雙功能化的HS-PEG2000-COOH偶聯(lián)轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)和PSSPH,合成Tf-PSSPH聚合物;同時(shí)選用PEG-PAMAM(PP)和PEG-PAMAM-His(PPH)兩種聚合物作為對(duì)照,并在此基礎(chǔ)上制備了PP/DOX、PPH/DOX、PSSPH/DOX和Tf-PSSPH/DOX四種復(fù)合物。采用氫譜(1H NMR)和動(dòng)態(tài)光散射(DLS)對(duì)載體的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)進(jìn)行表征,透析袋法考察其體外藥物釋放行為;MTT法對(duì)聚合物的細(xì)胞毒性進(jìn)行考察,并計(jì)算比較各復(fù)合物IC50值;以異硫氰酸羅丹明B(RBITC)為熒光探針標(biāo)記四種聚合物,通過(guò)共聚焦顯微鏡(CLSM)考察其在胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)情況;采用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀定性及定量地考察HepG2細(xì)胞對(duì)載藥系統(tǒng)的攝取情況;通過(guò)不同的細(xì)胞抑制劑考察細(xì)胞內(nèi)吞攝取途徑,同時(shí)采用CLSM對(duì)攝取的復(fù)合物進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究;小動(dòng)物活體成像技術(shù)和體內(nèi)的抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)復(fù)合物體內(nèi)靶向性和抗腫瘤效果;最后通過(guò)HE染色和TUNEL染色法考察復(fù)合物的組織毒性及腫瘤組織凋亡情況。結(jié)果:成功合成不同His修飾程度的PH,實(shí)驗(yàn)篩選得到最佳的His和PAMAM投料比為32:1;在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步合成了PP、PPH、PSSPH、Tf-PSSPH四種聚合物,并包載化療藥物DOX,所制備的載藥復(fù)合物粒徑都在15~20 nm之間,具有較高的包封率,且載藥量都在10%以上。體外釋放結(jié)果顯示Tf-PSSPH具有明顯的pH氧化還原敏感性。在一定濃度范圍內(nèi),各載體對(duì)腫瘤細(xì)胞均無(wú)明顯毒性,表明該載體具有良好的生物相容性。Tf-PSSPH/DOX復(fù)合物對(duì)腫瘤的抑制率明顯高于未經(jīng)Tf修飾的復(fù)合物,同樣細(xì)胞對(duì)Tf-PSSPH/DOX復(fù)合物的攝取高于PSSPH/DOX。細(xì)胞攝取機(jī)制表明Tf-PSSPH/DOX復(fù)合物主要通過(guò)Tf與TfR相結(jié)合,然后通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。CLSM結(jié)果表明聚合物進(jìn)入細(xì)胞后主要分布在溶酶體中,并能從溶酶體快速逃逸出來(lái)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中,從而在高濃度谷胱甘肽(GSH)的刺激下發(fā)生二硫鍵斷裂,迅速釋放其包載的藥物。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與PSSPH/DOX相比,Tf-PSSPH/DOX能快速到達(dá)腫瘤部位,且能明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)。HE染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Tf-PSSPH/DOX相對(duì)于游離DOX組表現(xiàn)出良好的安全性,對(duì)正常組織器官無(wú)明顯損傷。TUNEL染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證Tf-PSSPH/DOX組腫瘤凋亡情況較為明顯。結(jié)論:本文成功構(gòu)建了Tf-PSSPH/DOX多功能靶向給藥系統(tǒng)。所制備的復(fù)合物具有較高的載藥量和包封率,且體外釋放呈現(xiàn)良好的pH-氧化還原雙敏感。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明Tf-PSPSH/DOX能夠快速到達(dá)腫瘤部位,并高效釋放藥物,有效抑制腫瘤生長(zhǎng),而且能顯著降低化療藥物的毒副作用,在癌癥治療中將具有潛在的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子 pH-氧化還原雙敏感 組氨酸修飾 轉(zhuǎn)鐵蛋白 抗腫瘤
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R943
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-14
• 前言14-23
• 1 聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子的研究進(jìn)展14-16
• 1.1 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)14-15
• 1.2 主要應(yīng)用15-16
• 2 環(huán)境響應(yīng)性納米給藥系統(tǒng)16-18
• 3 組氨酸簡(jiǎn)介18-19
• 4 模型藥物DOX簡(jiǎn)介19
• 5 轉(zhuǎn)鐵蛋白介導(dǎo)的主動(dòng)靶向給藥系統(tǒng)19-20
• 6 課題設(shè)計(jì)思路及研究?jī)?nèi)容20-23
• 6.1 本課題的設(shè)計(jì)思路20-21
• 6.2 本文主要研究?jī)?nèi)容21-23
• 第一章 PAMAM-His/DOX復(fù)合物的制備及評(píng)價(jià)23-34
• 一、PAMAM-His聚合物的合成及性質(zhì)表征23-26
• 1 材料與儀器23
• 1.1 材料23
• 1.2 儀器23
• 2 實(shí)驗(yàn)方法23-24
• 2.1 PAMAM-His聚合物的合成23-24
• 2.2 PAMAM-His的1H-NMR結(jié)構(gòu)確證24
• 2.3 PAMAM-His粒徑和Zeta電位測(cè)定24
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-26
• 3.1 PAMAM-His的1H NMR分析24-25
• 3.2 PAMAM-His粒徑和Zeta電位25-26
• 二、PAMAM-His/DOX復(fù)合物的制備及評(píng)價(jià)26-34
• 1 材料與儀器26
• 1.1 材料26
• 1.2 儀器26
• 1.3 細(xì)胞26
• 2 實(shí)驗(yàn)方法26-29
• 2.1 DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建26
• 2.2 PAMAM-His/DOX復(fù)合物的制備與表征26-27
• 2.3 PAMAM-His/DOX復(fù)合物的體外釋放實(shí)驗(yàn)27-28
• 2.4 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)28
• 2.5 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)28
• 2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析28-29
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-32
• 3.1 DOX的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制29
• 3.2 復(fù)合物的表征29-30
• 3.3 復(fù)合物的體外釋放30
• 3.4 體外細(xì)胞毒性30-32
• 3.5 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)32
• 4 本章小結(jié)32-34
• 第二章 Tf-PEG-SS-PAMAM-His聚合物的合成及性質(zhì)表征34-46
• 1 材料與儀器34-35
• 1.1 材料34
• 1.2 儀器34
• 1.3 細(xì)胞34-35
• 2 實(shí)驗(yàn)方法35-38
• 2.1 聚合物的合成35-36
• 2.2 聚合物的結(jié)構(gòu)確證36-37
• 2.3 粒徑和Zeta電位測(cè)定37
• 2.4 RBITC標(biāo)記的聚合物胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)考察37-38
• 3 結(jié)果與討論38-45
• 3.1 聚合物的1H NMR分析38-40
• 3.2 轉(zhuǎn)鐵蛋白連接數(shù)量測(cè)定結(jié)果40
• 3.3 粒徑和Zeta電位測(cè)定40-41
• 3.4 RBITC標(biāo)記的聚合物胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)考察41-45
• 4 本章小結(jié)45-46
• 第三章 Tf-PAMAM-SS-PEG-His/DOX復(fù)合物的制備及評(píng)價(jià)46-52
• 1 材料與儀器46
• 1.1 材料46
• 1.2 儀器46
• 1.3 細(xì)胞46
• 2 實(shí)驗(yàn)方法46-48
• 2.1 復(fù)合物的制備46-47
• 2.2 復(fù)合物的表征47-48
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-51
• 3.1 復(fù)合物粒徑、Zeta電位48
• 3.2 復(fù)合物的包封率及載藥量48-49
• 3.3 體外pH-氧化還原雙敏感釋放行為考察49-51
• 4 本章小結(jié)51-52
• 第四章 復(fù)合物體外抗腫瘤活性及其機(jī)制研究52-67
• 1 材料與儀器52-53
• 1.1 材料52
• 1.2 儀器52
• 1.3 細(xì)胞52-53
• 1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物53
• 2 實(shí)驗(yàn)方法53-57
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)53
• 2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)53-54
• 2.3 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)54-55
• 2.4 細(xì)胞內(nèi)藥物分布研究55
• 2.5 攝取機(jī)制考察55-56
• 2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析56-57
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果57-65
• 3.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果57-58
• 3.2 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果58-59
• 3.3 細(xì)胞內(nèi)藥物分布研究59-61
• 3.4 攝取機(jī)制考察61-65
• 4 本章小結(jié)65-67
• 第五章 復(fù)合物體內(nèi)抗腫瘤活性的研究67-75
• 1 材料與儀器67
• 1.1 材料67
• 1.2 儀器67
• 1.3 細(xì)胞67
• 1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物67
• 2 實(shí)驗(yàn)方法67-69
• 2.1 HepG2荷瘤裸鼠模型的建立67-68
• 2.2 荷瘤裸鼠活體熒光成像實(shí)驗(yàn)68
• 2.3 荷瘤裸鼠體內(nèi)抗腫瘤活性研究68
• 2.4 腫瘤和各主要器官的病理學(xué)觀察68
• 2.5 TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡68-69
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果69-73
• 3.1 荷瘤裸鼠活體熒光成像實(shí)驗(yàn)69-70
• 3.2 體內(nèi)抗腫瘤活性研究70-71
• 3.3 腫瘤和各主要器官的病理學(xué)觀察71-73
• 3.4 TUNEL法檢測(cè)腫瘤組織的凋亡73
• 4 本章小結(jié)73-75
• 全文總結(jié)75-77
• 后續(xù)工作與展望77-78
• 參考文獻(xiàn)78-84
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文84-85
• 縮略詞表85-87
• 致謝87-88

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本文編號(hào)：876830