本文關(guān)鍵詞：重組人白細(xì)胞介素-29突變體的真核表達(dá)及抑制腫瘤細(xì)胞增殖分析

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【摘要】：人白細(xì)胞介素-29(Interleukin-29,h IL-29),也被稱作干擾素λ1,為2003年發(fā)現(xiàn)的一種新型細(xì)胞因子。hIL-29與其受體復(fù)合物(由IFN-λR1及IL-10R2兩個(gè)亞基組成)結(jié)合激活JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,因此h IL-29的生物學(xué)效應(yīng)包括抑制腫瘤增殖、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等。h IL-29的受體表達(dá)具有組織特異性,因此h IL-29的毒副作用較小,故有望成為新型基因工程類藥物進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)。用生物信息學(xué)軟件將hIL-29的三級(jí)結(jié)構(gòu)與人白細(xì)胞介素-28B(Interleukin-28B,h IL-28B)的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn),h IL-29在A螺旋中有3個(gè)氨基酸殘基(33Lys、35Arg、43Lys)與hIL-28B中對(duì)應(yīng)氨基酸殘基(34Arg、36Lys、44Leu)不同,F螺旋中143Ala與IL-28B中144Pro不同。以h IL-28B的相應(yīng)氨基酸為參照,對(duì)hIL-29中43Lys和143Ala進(jìn)行定點(diǎn)突變,并研究h IL-29突變體抗腫瘤細(xì)胞增殖活性。采用大引物PCR方法對(duì)hIL-29基因進(jìn)行點(diǎn)突變,得到的hIL-29突變體基因經(jīng)重組后轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115和誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)純化獲得重組蛋白質(zhì)hIL-29K43L和hIL-29A143P,高效液相色譜檢測(cè)純度達(dá)到98.17%和97.83%。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析顯示重組蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量約23.0 kDa,Western-Blotting鑒定顯示其與羊抗人IL-29多克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。用CCK-8試劑檢測(cè)重組蛋白質(zhì)hIL-29K43L和hIL-29A143P對(duì)腫瘤細(xì)胞株(人胃癌SGC7901、人結(jié)腸癌HCT8、人肝癌BEL7402、人肺腺癌A549和人急性單核白血病THP1)增殖的影響檢測(cè),結(jié)果顯示h IL-29K43L和h IL-29A143P對(duì)上述腫瘤細(xì)胞株均有抑制作用,而且高劑量組的抗增殖效應(yīng)高于野生型rhIL-29的,其中hIL-29K43L對(duì)上述腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率為(29.42±1.76)%、(29.42±1.76)%、(29.42±0.74)%、(27.09±3.85)%和(25.09±3.89)%;h IL-29A143P對(duì)上述腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率為(25.20±3.30)%、(23.84±2.93)%、(28.57±0.80)%、(25.96±1.41)%和(27.86±1.63)%。表明對(duì)h IL-29的受體結(jié)合區(qū)域氨基酸進(jìn)行改造,可以提高其抗腫瘤細(xì)胞增殖活性,這為進(jìn)一步研制開(kāi)發(fā)h IL-29的抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：人白細(xì)胞介素-29 定點(diǎn)突變 重組蛋白質(zhì) 抗腫瘤細(xì)胞增殖活性
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 第一章 緒論7-17
• 1.1 干擾素的概述7
• 1.2 h IL-29的結(jié)構(gòu)7-8
• 1.2.1 IL-29的基因結(jié)構(gòu)7-8
• 1.2.2 h IL-29的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)8
• 1.3 h IL-29的表達(dá)8-9
• 1.4 h IL-29的受體及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路9-10
• 1.4.1 h IL-29受體組成9
• 1.4.2 h IL-29受體的表達(dá)9
• 1.4.3 h IL-29的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路9-10
• 1.5 h IL-29的生物學(xué)效應(yīng)10-13
• 1.5.1 h IL-29的抗病毒活性11-12
• 1.5.2 h IL-29的免疫調(diào)節(jié)活性12
• 1.5.3 IL-29的抗增殖活性12
• 1.5.4 h IL-29的抗腫瘤活性12-13
• 1.6 h IL-29的臨床應(yīng)用及國(guó)內(nèi)研究進(jìn)展13-14
• 1.6.1 h IL-29的臨床應(yīng)用13
• 1.6.2 h IL-29的國(guó)內(nèi)研究進(jìn)展13-14
• 1.7 立題意義和主要內(nèi)容14-17
• 1.7.1 立題意義14-15
• 1.7.2 主要內(nèi)容15-17
• 第二章 材料與方法17-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料17-19
• 2.1.1 菌株、質(zhì)粒和重組蛋白質(zhì)17
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株17
• 2.1.3 主要試劑及耗材17-18
• 2.1.4 培養(yǎng)基18
• 2.1.5 主要儀器18-19
• 2.1.6 常用試劑的配制19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法19-34
• 2.2.1 h IL-29突變位點(diǎn)的確定19
• 2.2.2 PCR引物設(shè)計(jì)及合成19-20
• 2.2.3 h IL-29變異體cDNA的克隆20-21
• 2.2.4 重組克隆質(zhì)粒pUCm-T-hIL-29K43L和pUCm-T-hIL-29A143P的構(gòu)建21-24
• 2.2.5 重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KM-hIL-29K43L和pPIC9KM-hIL-29A143P的構(gòu)建24-26
• 2.2.6 重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母及高拷貝重組菌株的篩選鑒定26-27
• 2.2.7 重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及高產(chǎn)菌株的篩選27-29
• 2.2.8 重組蛋白質(zhì)rh IL-29K43L、rhIL-29A143P的分離純化與鑒定29-31
• 2.2.9 抗腫瘤細(xì)胞增殖活性分析31-34
• 第三章 結(jié)果與討論34-48
• 3.1 h IL-29突變位點(diǎn)的確定34
• 3.2 h IL-29變異體cDNA的克隆34-35
• 3.3 重組克隆質(zhì)粒pUCm-T-hIL-29K43L和pUCm-T-hIL-29A143P的構(gòu)建及鑒定35-36
• 3.3.1 pUCm-T-hIL-29K43L和pUCm-T-hIL-29A143P的菌液PCR鑒定35-36
• 3.3.2 pUCm-T-hIL-29K43L和pUCm-T-hIL-29A143P的雙酶切鑒定36
• 3.4 重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KM-hIL-29K43L和pPIC9KM-hIL-29A143P的構(gòu)建及鑒定36-37
• 3.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母及高拷貝重組菌株的篩選鑒定37-38
• 3.6 重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及高產(chǎn)菌株的篩選38-39
• 3.6.1 重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)38
• 3.6.2 SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物及高產(chǎn)菌株篩選38-39
• 3.6.3 Western-Blotting鑒定重組蛋白質(zhì)rhIL-29K43L、rhIL-29A143P39
• 3.7 重組蛋白質(zhì)rhIL-29K43L、rhIL-29A143P分離純化與鑒定39-42
• 3.7.1 重組蛋白質(zhì)rh IL-29K43L、rhIL-29A143P分離純化39-40
• 3.7.2 SDS-PAGE分析鑒定40-41
• 3.7.3 Western-Blotting分析鑒定41-42
• 3.7.4 高效液相色譜色譜（HPLC）純度鑒定42
• 3.8 抗腫瘤細(xì)胞增殖活性分析42-48
• 3.8.1 抗人胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖活性分析42-43
• 3.8.2 抗人結(jié)腸癌HCT8細(xì)胞的增殖活性分析43-44
• 3.8.3 抗人肝癌BEL7402細(xì)胞的增殖活性分析44-45
• 3.8.4 抗人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖活性分析45-46
• 3.8.5 抗人急性單核白血病THP1細(xì)胞增殖分活性分析46-48
• 主要結(jié)論與展望48-50
• 主要結(jié)論48
• 展望48-50
• 致謝50-51
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 附錄: 作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文56

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本文編號(hào)：875802