本文關(guān)鍵詞：陽(yáng)離子卟啉光敏劑的光動(dòng)力抗菌活性及作用機(jī)制研究

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【摘要】：本論文主要包括四個(gè)方面：第一部分光動(dòng)力抗菌活性化合物的計(jì)算化學(xué)研究本部分為了探討光敏劑和光動(dòng)力抗菌活性化合物的定量結(jié)構(gòu)-性質(zhì)關(guān)系(QSPR, quantitative structure-property relationships),我們運(yùn)用計(jì)算化學(xué)方法建立150個(gè)光敏劑和202個(gè)光動(dòng)力抗菌活性化合物的QSPR模型,采用主成分分析法(PCA, principal component analysis)將多維化學(xué)空間映射到二維空間,揭示光敏抗菌分子的化學(xué)空間分布。結(jié)果顯示大部分光動(dòng)力抗菌活性化合物并不遵循Lipinski的“類(lèi)藥性五原則”,我們初步歸納總結(jié)適合光敏劑研究的相似性評(píng)價(jià)原則：分子量小于1500；氫鍵供體數(shù)目小于10；氫鍵受體數(shù)目小于12；脂水分布系數(shù)小于8；可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)目不超過(guò)15個(gè)。主成分分析結(jié)果顯示光動(dòng)力抗菌活性化合物和光敏藥物之間既存在相同的化學(xué)空間和屬性又表現(xiàn)出物理化學(xué)性質(zhì)方面的差異。第二部分 陽(yáng)離子卟啉光敏劑LD4的含量測(cè)定本部分采用反相高效液相色譜建立LD4含量測(cè)定方法并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證,結(jié)果顯示LD4檢測(cè)質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍為1.55-95μg/mL (r=0.9994);精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD1.0%；檢測(cè)限和定量限分別為1.1和3.8ng。該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性強(qiáng),適用于LD4的質(zhì)量控制。第三部分 陽(yáng)離子卟啉光敏劑LD4的體外抗菌活性研究本部分研究了陽(yáng)離子卟啉光敏劑LD4對(duì)銅綠假單胞桿菌(P. aeruginosa)的光動(dòng)力殺傷作用并探討其作用機(jī)制。采用瓊脂二倍稀釋法考察細(xì)菌接種量、培養(yǎng)基pH值和血清蛋白含量對(duì)LD4最小抑菌濃度(MIC)的影響,結(jié)果顯示當(dāng)接種量低于106CFU/mL時(shí),光反應(yīng)和暗反應(yīng)的MIC值均沒(méi)有變化,而當(dāng)接種量高于106CFU/mL時(shí),光反應(yīng)和暗反應(yīng)的MIC值均升高。隨著培養(yǎng)基pH值的升高,光反應(yīng)和暗反應(yīng)的MIC值逐漸增大。光反應(yīng)和暗反應(yīng)血清蛋白含量對(duì)MIC值的影響不同,隨著血清蛋白含量的增加,光反應(yīng)的MIC值逐漸升高,而暗反應(yīng)逐漸降低。采用平皿菌落計(jì)數(shù)法研究激光能量密度對(duì)PACT作用的影響,結(jié)果顯示隨著激光能量密度的升高,銅綠假單胞桿菌的存活率降低,且全部被滅活所需的光敏劑的量降低。采用平皿菌落計(jì)數(shù)法研究LD4對(duì)銅綠假單胞桿菌的抗菌后效應(yīng),結(jié)果顯示PACT作用后,P.aeruginosa存在明顯的抗菌后效應(yīng),且PAE值呈光敏劑劑量依賴(lài)性。2h后,各實(shí)驗(yàn)組存活的細(xì)菌會(huì)繼續(xù)增殖,經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期到達(dá)平臺(tái)期。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)LD4對(duì)銅綠假單胞桿菌細(xì)菌活性的影響,結(jié)果顯示PACT作用后,活菌比例隨著LD4濃度逐漸降低,且劑量依賴(lài)關(guān)系明顯。采用激光共聚焦顯微鏡、原子力顯微鏡以及掃描電子顯微鏡法觀察PACT作用對(duì)銅綠假單胞桿菌形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)果顯示PACT作用后銅綠假單胞桿菌形態(tài)破碎不完整或表面干扁粗糙變形,內(nèi)容物泄露,而正常細(xì)菌形態(tài)飽滿(mǎn),外膜光滑且完整。采用MTT法檢測(cè)光敏劑LD4對(duì)L929的光毒性影響,結(jié)果顯示LD4對(duì)L929細(xì)胞的光毒性的ICso值為7.08μM。LD4的濃度為3.9μM時(shí),L929的存活率超過(guò)80%。第四部分陽(yáng)離子卟啉光敏劑LD4的體內(nèi)抗菌活性研究本部分采用改良付小兵全層皮膚缺損法制成創(chuàng)傷感染性動(dòng)物潰瘍模型來(lái)評(píng)價(jià)陽(yáng)離子光敏劑LD4用于外傷感染治療的可行性,采用平皿菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定創(chuàng)面細(xì)菌數(shù)量,采用游標(biāo)卡尺測(cè)量創(chuàng)面直徑計(jì)算創(chuàng)面面積并計(jì)算創(chuàng)面愈合率,采用Elisa法檢測(cè)創(chuàng)面組織炎性細(xì)胞因子IL-6, TNF-a表達(dá)。結(jié)果顯示,與模型對(duì)照組相比,其他各治療組不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面菌落數(shù)明顯下降,創(chuàng)面愈合速度加快,Elisa檢測(cè)顯示炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-a的表達(dá)均下調(diào),減少創(chuàng)面炎癥反應(yīng),促進(jìn)血管再生以及傷口愈合。PACT高劑量治療組作用效果顯著且優(yōu)于抗生素治療組。
【關(guān)鍵詞】：光動(dòng)力抗菌化學(xué)療法 陽(yáng)離子卟啉光敏劑 銅綠假單胞桿菌 化學(xué)空間
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R96
【目錄】：

• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 前言11-23
• 1 研究背景11
• 2 細(xì)菌抗生素耐藥性機(jī)制11-13
• 2.1 酶誘導(dǎo)抗生素失活12
• 2.2 作用靶點(diǎn)改變12
• 2.3 藥物主動(dòng)外排泵系統(tǒng)和外膜通透性的變化12-13
• 3 PACT的提出13-17
• 3.1 PACT的主要作用機(jī)制13-14
• 3.2 PACT的主要優(yōu)勢(shì)14-15
• 3.3 PACT的體外抗菌研究15-16
• 3.4 PACT的體內(nèi)抗菌研究16-17
• 4 課題的提出17-18
• 參考文獻(xiàn)18-23
• 第一章 光動(dòng)力抗菌活性化合物的計(jì)算化學(xué)研究23-37
• 引言23
• 1 研究工具23
• 2 方法23-25
• 2.1 分子數(shù)據(jù)集的建立23-24
• 2.2 分子描述符的計(jì)算24
• 2.3 化學(xué)空間模型的建立24-25
• 3 結(jié)果25-29
• 3.1 結(jié)構(gòu)描述符的計(jì)算結(jié)果25-26
• 3.2 藥理學(xué)性質(zhì)的預(yù)測(cè)結(jié)果26-29
• 3.3 藥代動(dòng)力學(xué)特征的預(yù)測(cè)結(jié)果29
• 4 討論29-31
• 5 本章小結(jié)31
• 參考文獻(xiàn)31-37
• 第二章 陽(yáng)離子卟啉光敏劑LD_4的含量測(cè)定37-42
• 引言37
• 1 材料37
• 1.1 主要儀器與試劑37
• 1.2 光敏劑37
• 2 方法37-38
• 2.1 樣品溶液的制備37-38
• 2.2 測(cè)定方法38
• 3 結(jié)果38-40
• 3.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)38
• 3.2 線(xiàn)性范圍38-39
• 3.3 檢測(cè)限和定量限39
• 3.4 精密度實(shí)驗(yàn)39
• 3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)39
• 3.6 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)39-40
• 3.7 樣品含量測(cè)定40
• 4 討論40-41
• 5 本章小結(jié)41
• 參考文獻(xiàn)41-42
• 第三章 陽(yáng)離子卟啉光敏劑LD_4體外抗菌活性研究42-56
• 引言42
• 1 材料42-44
• 1.1 主要儀器與試劑42-43
• 1.2 實(shí)驗(yàn)菌株和培養(yǎng)基43
• 1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株及培養(yǎng)條件43-44
• 1.4 光敏劑44
• 2 方法44-47
• 2.1 細(xì)菌懸液的制備44
• 2.2 不同培養(yǎng)條件對(duì)LD_4抑菌活性的影響44
• 2.3 激光能量密度對(duì)P.aeruginosa的PACT的影響44-45
• 2.4 體外抗菌后效應(yīng)(PAE)的測(cè)定45
• 2.5 流式細(xì)胞儀法檢測(cè)PACT對(duì)P.aeruginosa活性的影響45
• 2.6 細(xì)菌形態(tài)學(xué)和微觀結(jié)構(gòu)的觀察45-46
• 2.7 MTT法測(cè)定光敏劑LD_4對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929的光毒性46-47
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法47
• 3 結(jié)果47-51
• 3.1 不同培養(yǎng)條件對(duì)LD_4抑菌活性的影響47-48
• 3.2 激光能量密度對(duì)P.aeruginosa PACT的影響48
• 3.3 體外抗菌后效應(yīng)48-50
• 3.4 流式細(xì)胞儀法檢測(cè)PACT 對(duì)P.aeruginosa活性的影響50
• 3.5 細(xì)菌形態(tài)學(xué)與微觀結(jié)構(gòu)的觀察50
• 3.6 LD_4對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929的細(xì)胞毒50-51
• 4 討論51-53
• 5 本章小結(jié)53
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 第四章 陽(yáng)離子卟啉光敏劑LD_4體內(nèi)抗菌活性研究56-64
• 引言56
• 1 材料56-57
• 1.1 主要儀器與試劑56
• 1.2 實(shí)驗(yàn)菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物56-57
• 1.3 光敏劑57
• 2 方法57-58
• 2.1 動(dòng)物模型的建立57
• 2.2 動(dòng)物分組及治療57-58
• 2.3 動(dòng)物取材58
• 2.4 在體細(xì)菌測(cè)定58
• 2.5 創(chuàng)面愈合率觀察58
• 2.6 Elisa法檢測(cè)創(chuàng)面組織IL-6,TNF-α的表達(dá)58
• 2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法58
• 3 結(jié)果58-60
• 3.1 在體細(xì)菌測(cè)定58-59
• 3.2 創(chuàng)面愈合率59-60
• 3.3 Elisa法檢測(cè)創(chuàng)面組織IL-6,TNF-α的表達(dá)60
• 4 討論60-61
• 5 本章小結(jié)61-62
• 參考文獻(xiàn)62-64
• 個(gè)人簡(jiǎn)介64-65
• 致謝65

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