本文關(guān)鍵詞：谷胱甘肽的合成及其活性的初步評價

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【摘要】：谷胱甘肽(Glutathione)是人體內(nèi)源活性肽之一,廣泛存在于動、植物中,在生物體內(nèi)有著重要的作用�，F(xiàn)代藥理實驗表明,其不僅具有較強的清除自由基作用,還可以用于肝、腎細胞膜的保護、有機物中毒、抑制肺間質(zhì)纖維化等多種生理功能�，F(xiàn)被廣泛應用于肝腎保護、解毒、抗癌等醫(yī)學領(lǐng)域[1]。由于其分子小,容易被肌體吸收,不易被消化酶破壞,可作為食品添加劑,提高營養(yǎng),加強食品風味及防止變質(zhì)[2],同時可制成復合制劑和保健藥品用于人體保健[3-5],此外將其添加到化妝品中,美白效果明顯優(yōu)于普通化妝品。近年來,國內(nèi)外對谷胱甘肽的作用機制等已經(jīng)做了大量的理論和實踐研究。目前的研究主要集中在藥理作用和新用途開發(fā)上,隨著其應用范圍越來越廣,需求量日益增加,而目前的生產(chǎn)工藝方法如發(fā)酵法等因胞內(nèi)產(chǎn)物含量低,細胞密度低、生產(chǎn)周期長等問題,生產(chǎn)規(guī)模有限,不能很好的適應工業(yè)化生產(chǎn)的需求。還原型谷胱甘肽(GSH)由谷、胱、甘種氨基酸組成,谷氨酸分別以α和γ羧基形成酰胺鍵,得到α-GSH與γ-GSH。其中α-GSH是非天然產(chǎn)物肽,其保留了活性位點-游離巰基(-SH),本研究中動物實驗研究表明,其肝損傷治療作用顯著。目前合成方法以液相合成法為主,但因操作復雜、生產(chǎn)周期長,不易純化等,應用受到限制。而氧化型谷胱甘肽(GSSG)是γ-GSH很好的協(xié)同抗氧化藥物,目前合成以雙氧水法為主,但其存在成本高、生產(chǎn)周期較長等問題。故探索國產(chǎn)谷胱甘肽的合成新工藝,并對工藝條件進行優(yōu)化,以降低成本,成為越來重要的課題。本研究先采用Fmoc固相合成法,以2-Cl-CTC樹脂為載體,DIC/HOBt為縮合劑,逐步縮合得到肽樹脂,經(jīng)不同的裂解劑裂解得粗肽,經(jīng)半制備純化后凍干,得α-GSH、γ-GSH純品。γ-GSH分別經(jīng)空氣、碘、雙氧水氧化后得GSSG。半制備純化后得純品,ESI-MS進行結(jié)構(gòu)分析鑒定,并比較三種合成藥物(α-GSH、γ-GSH、GSSG),與陽性對照藥(γ-GSH,發(fā)酵法所得)對四氯化碳誘導的小鼠急性肝損傷的療效差異,通過肝細胞形態(tài)學變化進行療效確證。為大規(guī)模生產(chǎn)實現(xiàn)提供基礎(chǔ)和理論支持。第一部分谷胱甘肽的化學合成目的:先采用fmoc固相合成方法合成α-gsh、γ-gsh,再利用不同的氧化方法將γ-gsh氧化為gssg,探索合成、切割、氧化、純化等條件,并確立所得產(chǎn)物的檢測方法,最終得到純度較高的目標產(chǎn)品。方法:1還原型谷胱甘肽的固相合成(α-gsh、γ-gsh)以fmoc固相合成方法分別合成α-gsh、γ-gsh。選擇適合、廉價的樹脂為載體,使用高效、副反應少、廉價的縮合體系,探索樹脂替代度、投料摩爾比、反應時間、反應溫度對合成結(jié)果的影響,以盡可能減少接肽過程中的副反應,最終獲得較好的純度和收率;接肽過程中利用kaiser反應以檢測氨基酸的連接程度。2肽樹脂的切割、純化根據(jù)氨基酸保護基團的不同,選擇不同的切割試劑配方,平行試驗,以粗肽的純度和收率為指標,優(yōu)化切割條件;切割后的多肽經(jīng)冰乙醚沉淀后得粗肽,真空干燥至恒重;反相半制備型hplc分離純化,冷凍干燥后獲得最終產(chǎn)品。3gssg的制備及純化以γ-gsh純品為原料,分別采用空氣、雙氧水、碘氧化法將其氧化為gssg;hplc監(jiān)測,以峰面積百分比為指標,優(yōu)化各種方法的反應條件;在各自的優(yōu)化條件下,以產(chǎn)物純度和收率為指標,以獲得較優(yōu)的氧化方法。4三種谷胱甘肽的結(jié)構(gòu)分析鑒定利用標準品hplc,對合成的α-gsh、γ-gsh、gssg進行定位,并進行hplc純度分析;esi-ms分析確證各自的分子量。結(jié)果:1α-gsh、γ-gsh為短肽,沒有復雜的空間結(jié)構(gòu),故選擇適合短肽合成且較廉價的2-cl-ctc樹脂為載體;縮合體系選擇產(chǎn)生高效、副反應少的dic/hobt;反應投料比在1:3時能充分反應;反應時間2.5h即可,但由于cys易消旋,宜縮短反應時間在2h左右;反應溫度以室溫(25℃~35℃)較好;替代度在0.9~0.95mmol/g時較好,優(yōu)選0.94mmol/g。2γ-gsh的四種切割試劑脫除保護基的效果相似,但有差異,綜合考慮所得粗肽純度、收率及成本,以切割配方tfa:edt:間甲酚(95:4:1)較優(yōu)。α-gsh肽樹脂的裂解效果與之類似。切割實驗時,反應液宜在冰浴之中冷凍0.5h,再逐步升至室溫(30℃)繼續(xù)反映1h得到的產(chǎn)物副反應少,純度好,產(chǎn)品穩(wěn)定且收率較高。3通過hplc圖譜峰面積百分比比較,獲得了各自較優(yōu)的氧化條件:空氣(室溫、底物濃度20mg/ml、ph6,反應72h);碘(室溫、底物濃度150mg/l、碘與底物摩爾比1:1.5,ph3,反應0.5h);雙氧水(室溫、底物濃度200mg/ml、30%雙氧水用量5%,ph6,反應時間2h);在各自優(yōu)化條件下,各氧化法所得gssg純度分別為90%、98%、95%,收率分別為70%、90%、91%。4合成的α-gsh、γ-gsh、gssg經(jīng)hplc經(jīng)標準品定位,esi-ms確證分子量,合成正確;所獲得的α-gsh、γ-gsh純品的純度大于99%,gssg純度大于98%。結(jié)論:本課題先采用fmoc固相合成法合成得到了α-gsh、γ-gsh純品,并在氧化劑作用下將γ-gsh純品氧化成gssg;在合成過程中優(yōu)化了合成、裂解、氧化、純化等條件;所得產(chǎn)物經(jīng)hplc定位,esi-ms確證分子量,均與理論值相符。第二部分合成谷胱甘肽對小鼠急性肝損傷療效初步評價目的:通過動物實驗觀察三種合成谷胱甘肽(α-gsh、γ-gsh、gssg,實驗室合成)與陽性對照藥(注射用γ-gsh,市售)對四氯化碳(ccl4)誘導的小鼠急性肝損傷的治療效果,以初步評價其活性。方法:1采用經(jīng)典的ccl4誘導昆明系成年雄性小鼠急性肝損傷方法造模;造模成功后,每24h按80mg/kg、40mg/kg、20mg/kg劑量給予小鼠合成藥物,并設(shè)立對照組,連續(xù)腹腔注射給藥7d,觀察各組小鼠血清中alt、ast活性水平的變化,并對實驗結(jié)果進行兩樣本均數(shù)的t檢驗統(tǒng)計學分析。2給藥7 d后處死動物,采取各組小鼠新鮮肝臟組織,HE染色后,觀察各組細胞形態(tài)學差異,以確定合成谷胱甘肽對小鼠急性肝損傷的療效。結(jié)果:1通過各組間兩樣本t檢驗知,三種合成化學物高劑量(80 mg/kg)、中劑量(40 mg/kg)可以顯著降低小鼠血清中ALT、AST水平(P0.01),且其治療效果與同等劑量的注射用γ-GSH無顯著性差異(P0.05),而低劑量(20 mg/kg)可以一定程度的降低小鼠肝臟ALT、AST水平(P0.05)。2小鼠肝臟組織經(jīng)HE染色后,顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),正常對照組,三組高、中劑量給藥組小鼠肝細胞排列規(guī)則,形態(tài)結(jié)構(gòu)較正常,核質(zhì)分布均勻,中央靜脈及匯管區(qū)清晰可見,CC14模型組小鼠肝組織損傷嚴重,肝細胞排列紊亂,多數(shù)肝細胞水腫,有明顯的壞死現(xiàn)象,壞死區(qū)肝細胞發(fā)生不同程度的氣球樣變,肝竇以及肝中央靜脈擴張。結(jié)論:合成的谷胱甘肽高(80 mg/kg)、中(40 mg/kg)劑量都可顯著降低小鼠肝臟ALT、AST水平,且其治療效果與同等劑量的注射用γ-GSH無顯著差異,提示該方法可以考慮作為谷胱甘肽合成新方法。
【關(guān)鍵詞】：谷胱甘肽 Fmoc固相合成 切割 分離純化 氧化 分析鑒定 急性肝損傷 生物活性
【學位授予單位】：承德醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R914.5;R96
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 英文縮寫15-16
• 引言16-18
• 第一部分 谷胱甘肽的化學合成18-56
• 前言18
• 材料與方法18-30
• 結(jié)果30-33
• 附圖33-44
• 附表44-50
• 討論50-53
• 小結(jié)53-54
• 參考文獻54-56
• 第二部分 合成谷胱甘肽對小鼠急性肝損傷保護作用初步評價56-72
• 前言56-57
• 材料與方法57-60
• 結(jié)果60-62
• 附圖62-64
• 附表64-68
• 討論68-69
• 小結(jié)69-70
• 參考文獻70-72
• 結(jié)論72-73
• 綜述73-80
• 參考文獻78-80
• 致謝80-81
• 個人簡歷81

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 金春英;崔京蘭;崔勝云;;氧化型谷胱甘肽對還原型谷胱甘肽清除自由基的協(xié)同作用[J];分析化學;2009年09期

2 李新社;;COPD患者行機械通氣治療時應用還原型谷胱甘肽的臨床效果[J];中國醫(yī)學工程;2012年12期

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本文編號：874477