本文關鍵詞：精氨酸脫亞胺酶位點突變對聚乙二醇修飾的影響研究

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【摘要】：研究目的:對野生型ADI(wADI)進行定點突變改造,構建突變型ADI(mADI)大腸桿菌重組表達系統(tǒng),篩選出高表達的重組工程菌。建立重組mADI的發(fā)酵工藝和純化工藝。對比分析位點突變對酶活性的影響。對野生型和突變型ADI進行PEG修飾和純化,對比分析位點突變對PEG修飾ADI的影響。研究方法:(1)ADI突變位點的設計與構建表達(1)根據支原體來源的野生型ADI蛋白序列設計大腸桿菌密碼偏愛性的突變型ADI基因序列并對其全基因合成。將全基因合成的mADI插入到pET-3a,構建重組質粒pET-3a-mADI。(2)重組質粒pET-3a-mADI轉化至表達宿主菌E.coli BL21(DE3),采用抗性篩選法獲得重組工程菌。(3)搖瓶表達篩選高表達菌株并進行30L體系放大發(fā)酵表達。(2)ADI的純化工藝和酶活性研究:(1)通過高壓勻漿法破菌、包涵體洗滌、稀釋復性、DEAE陰離子交換層析、Butyl疏水層析等工藝獲得純的目的蛋白。(2)對純化后的wADI和mADI分別進行紫外法測活,對比分析位點突變對酶活性的影響。(3)ADI的PEG修飾研究:(1)采用PEG-5k對兩種酶進行不同比例的修飾。(2)采用分子篩法對修飾后的樣品進行純化,獲得高純度的修飾樣品。(3)采用SEC-HPLC/UV-RI紫外示差聯(lián)用法測定平均修飾度,體外測活法對修飾樣品測活,對比分析位點突變對PEG修飾ADI的影響。結論:經雙酶切和基因測序法對構建的重組質粒進行檢測,成功構建了重組表達質粒pET-3a-mADI,目的基因在大腸桿菌中以包涵體形式表達,表達量高達30%。建立并確定了mADI的搖瓶表達和發(fā)酵罐放大培養(yǎng)條件。探索并建立了穩(wěn)定的純化工藝,SDS-PAGE和HPLC純度都高于95%以上。經體外測活對比分析,突變位點未對酶活性產生明顯的影響。成功實現wADI和mADI不同摩爾比例的PEG修飾,并通過純化獲得各自單一的修飾產物。對比分析這兩種酶進行PEG修飾前后的差異和相關性(PEG修飾個數的差異,修飾位點的差異、酶活性差異等),證明了突變位點會影響PEG與精氨酸脫亞胺酶結合,在wADI相應的位點極易被PEG修飾,而經過突變后該位點不能夠被PEG修飾,在相同修飾比例下突變型精氨酸脫亞胺酶(mADI)平均修飾度均比野生型精氨酸脫亞胺酶(wADI)平均修飾度少1個,最終在酶活性上存在差異,不論相同比例下獲得的修飾產物,還是不同修飾比例獲得相同修飾個數得產物,突變后的PEG-mADI(m ADI)酶活均高于野生型PEG-wADI(wADI)。這為后期開發(fā)低免疫原性,高活性的精氨酸脫亞胺酶奠定了理論和實踐基礎。
【關鍵詞】：精氨酸脫亞胺酶 突變 純化 聚乙二醇 酶活
【學位授予單位】：重慶理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R943
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 英文縮略表12-14
• 1 緒論14-25
• 1.1 精氨酸脫亞胺酶簡介14-17
• 1.1.1 ADI的來源及性質14-15
• 1.1.2 ADI的用途15-17
• 1.1.2.1 ADI具有抗癌潛力15-17
• 1.1.2.2 ADI具有預防齲齒的作用17
• 1.1.2.3 ADI用于生產L-瓜氨酸17
• 1.2 精氨酸脫亞胺酶研究進展17-20
• 1.2.1 ADI抗腫瘤研究進展17-18
• 1.2.2 ADI的突變研究18-20
• 1.3 聚乙二醇修飾蛋白技術20-23
• 1.3.1 聚乙二醇修飾方法簡介20-21
• 1.3.2 聚乙二醇修飾精氨酸脫亞胺酶的研究概況21-23
• 1.4 本課題研究目的23
• 1.5 研究內容和技術路線23-25
• 1.5.1 研究內容23-24
• 1.5.2 技術路線24-25
• 2 精氨酸脫亞胺酶突變位點的設計與構建表達25-40
• 2.1 材料25-29
• 2.1.1 主要試劑和耗材25-26
• 2.1.2 基本溶液的配制26-27
• 2.1.3 菌株和質粒27-28
• 2.1.4 主要儀器28-29
• 2.2 實驗方法29-36
• 2.2.1 目的基因的獲得29
• 2.2.2 重組質粒pET3a-wADI/mADI的構建及鑒定29-33
• 2.2.2.1 載體酶切和膠回收30-31
• 2.2.2.2 連接反應31
• 2.2.2.3 感受態(tài)細胞（DH5α）制備31
• 2.2.2.4 連接產物轉化31-32
• 2.2.2.5 重組質粒篩選及鑒定32-33
• 2.2.3 重組質粒pET3a-wADI/mADI表達33-36
• 2.2.3.1 表達感受態(tài)細胞制備33-34
• 2.2.3.2 重組質粒pET3a-wADI/mADI的轉化及篩選34
• 2.2.3.3 重組wADI/mADI蛋白搖瓶表達34
• 2.2.3.4 SDS-PAGE檢測表達蛋白34-35
• 2.2.3.5 放大培養(yǎng)發(fā)酵35-36
• 2.3 結果與分析36-38
• 2.3.1 重組質粒pET3a-wADI/mADI的構建及鑒定36-37
• 2.3.2 重組質粒pET3a-wADI/mADI表達37-38
• 2.4 小結38-40
• 3 突變型精氨酸脫亞胺酶純化與性質研究40-53
• 3.1 引言40
• 3.2 材料40-42
• 3.2.1 主要試劑40-41
• 3.2.2 主要設備和儀器41
• 3.2.3 主要緩沖配制41-42
• 3.3 包涵體前處理研究42-43
• 3.3.1 高壓勻漿破菌研究42-43
• 3.3.2 包涵體洗滌研究43
• 3.3.3 變性和復姓研究43
• 3.4 重組ADI蛋白的純化研究43-45
• 3.4.1 DEAE柱層析純化43-44
• 3.4.2 Butyl柱層析純化44-45
• 3.5 突變體ADI蛋白性質對比研究45-47
• 3.5.1 純度檢測45-46
• 3.5.2 Lowry法測定蛋白濃度46
• 3.5.3 酶活測定46-47
• 3.6 結果與討論47-51
• 3.6.1 包涵體前處理結果和分析47-48
• 3.6.2 重組ADI蛋白的純化結果和分析48-49
• 3.6.3 ADI蛋白性質對比結果分析49-51
• 3.7 本章小結51-53
• 4 精氨酸脫亞胺酶PEG修飾研究53-70
• 4.1 前言53
• 4.2 材料53-55
• 4.2.1 主要試劑53-54
• 4.2.2 主要設備和儀器54
• 4.2.3 主要緩沖配制54-55
• 4.3 方法55-60
• 4.3.1 不同比例PEG修飾研究：55
• 4.3.2 修飾產物的的純化55-56
• 4.3.3 PEG修飾產物的性質研究56-60
• 4.3.3.1 修飾產物的純度度檢測56-57
• 4.3.3.2 修飾產物濃度測定57
• 4.3.3.3 平均修飾度測定及對比分析57-59
• 4.3.3.4 酶活測定59-60
• 4.4 結果與討論60-69
• 4.4.1 修飾產物的純化60-61
• 4.4.2 PEG修飾產物的性質研究61-69
• 4.4.2.1 修飾產物的純度度檢測61-64
• 4.4.2.2 平均修飾度測定及對比分析64-67
• 4.4.2.4 酶活測定67-69
• 4.5 本章小結69-70
• 5 結論與展望70-72
• 5.1 結論70
• 5.2 本文的創(chuàng)新性70
• 5.3 展望70-72
• 致謝72-73
• 參考文獻73-76
• 個人簡歷、在學期間發(fā)表的學術論文及取得的研究成果76

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本文編號：804128