本文關(guān)鍵詞：一種非病毒siRNA載體材料的制備與性能研究

  更多相關(guān)文章： siRNA遞送 層層自組裝 殼聚糖-siRNA-透明質(zhì)酸(CHS-siRNA-HA)多層薄膜 基因沉默效應(yīng)

【摘要】：研究背景：當(dāng)下,如何改善siRNA藥物在人體內(nèi)的穩(wěn)定性、提高它的靶向性,如何促進其通過細胞內(nèi)吞作用被靶細胞攝取,如何開發(fā)siRNA的局部給藥方式,克服全身給藥帶來的siRNA用量大效率低等問題,成為siRNA給藥領(lǐng)域里一個個急待克服的難題。目的：制備一種能有效裝載和保護siRNA藥物的殼聚糖-siRNA-透明質(zhì)酸(CHS-siRNA-HA)多層薄膜非病毒載體,探究該藥物載體薄膜在溶液中的穩(wěn)定性,并對其基因沉默效應(yīng)做出評價。方法：利用層層自組裝(Layer-by-layer self-assembly, LBL)技術(shù),制備了CHS-siRNA-HA多層薄膜。通過UV-vis吸光度法,對組裝過程中條件的優(yōu)化、siRNA在薄膜上的生長過程,以及多層薄膜中的siRNA在不同緩釋液中(NaCl溶液、PBS溶液和純水溶液)的釋放情況,分別進行了分析驗證。用FTIR光譜法和13C-NMR波譜法,對CHS-siRNA-HA多層薄膜的組裝過程從分子結(jié)構(gòu)的角度進行了表征,對多層薄膜中高分子多聚物結(jié)合的作用機理,進行了初步探討。用原子力顯微鏡(AFM)觀察薄膜表面的形貌特征。結(jié)合UV-vis吸光度法和聚丙烯酰氨凝膠電泳(PAGE),對薄膜在緩釋液中的穩(wěn)定性和siRNA序列的完整性,進行了評價。結(jié)合結(jié)合熒光圖像和流式細胞術(shù),采用直接與細胞接觸的方式,對該siRNA載體薄膜的王IEK 293T細胞轉(zhuǎn)染效應(yīng),進行了檢測和評價。結(jié)果：(1) UV-vis法證明：第一、CHS-siRNA-HA多層薄膜在260nm處有很強的吸收峰,而且隨著含siRNA的組裝層數(shù)增加,在260 nm的吸光度值越大,由此驗證了siRNA在CHS-siRNA-HA多層薄膜上的生長過程；第二,CHS-siRNA-HA多層薄膜的制備過程,與組裝基底(石英片)的是否干燥和高分子多聚物溶液的是否過濾密切相關(guān),基底不干燥和對溶液過濾處理,都會減少多層薄膜上siRNA的吸附量大�。坏谌�,鹽離子濃度是影響本實驗中LBL制備的CHS-HA-siRNA多層薄膜崩解的重要因素,且鹽離子濃度小于1M時,多層薄膜崩解程度隨鹽離子濃度增加而增加。過低或者過高的鹽離子濃度對促進薄膜的崩解沒有優(yōu)勢；第四,該siRNA載體薄膜在鹽離子1 M NaCl溶液中釋放效果最好,在pH 7.4的PBS緩沖液中次之,在純水中穩(wěn)定性最好。(2) FTIR光譜法和13C-NMR波譜法則證明：CHS分子在氨基部位(-NH2)有交聯(lián)產(chǎn)生,另外HA的羥基(-OH)也參與了反應(yīng)過程,除了有靜電相互作用,可能還有其他的氫鍵相互作用。AFM測試結(jié)果表明,所有的薄膜的表面都不平整,加了siRNA以后,其薄膜表面整體上呈現(xiàn)明顯突起的山丘狀,另外產(chǎn)生了一些粒徑較小的顆粒狀物質(zhì)。(3) UV-vis法,結(jié)合聚丙烯酰氨凝膠電泳(PAGE)實驗,則證明了CHS-siRNA-HA多層組裝薄膜在1 M NaCl溶液中孵育大約6天經(jīng)后,siRNA幾乎完全從膜上崩解脫落,但是緩釋液中沒有游離的裸siRNA出現(xiàn),較好的驗證了(CHS/HA)4(CHS/HA-siRNA)9多層薄膜釋放出siRNA的穩(wěn)定性；而孵育10 d后得到的緩釋液,與HA-siRNA混合溶液,在相同位置出現(xiàn)了單一條帶,由此則較好的驗證了(CHS/HA)4(CHS/HA-siRNA)9多層薄膜釋放出siRNA序列的完整性。(4) OLYMPUS熒光顯微鏡圖像和BD FACSCALIBUR流式細胞儀統(tǒng)計結(jié)果均顯示,第一,陽性對照組2-eGFP-siRNA(組裝2層eGFP-siRNA的膜)和7-eGFP-siRNA(組裝7層eGFP-siRNA的膜),均發(fā)生了明顯的沉默綠色熒光蛋白的效應(yīng),說明我們的eGFP-siRNA從薄膜中釋放出來了,并發(fā)揮了其基因沉默效應(yīng)；第二,隨著細胞HEK 293T轉(zhuǎn)染過程的時間累積(1-3 d),2-eGFP-siRNA組的沉默綠色熒光蛋白基因的效果更明顯,說明基因沉默效應(yīng)與細胞轉(zhuǎn)染時間有關(guān)；第三,在細胞培養(yǎng)2d的轉(zhuǎn)染時間,7-eGFP-siRNA組的沉默綠色熒光蛋白基因的能力強于2-eGFP-siRNA組,說明基因沉默效應(yīng)與組裝的eGFP-siRNA層數(shù)多少有關(guān)。結(jié)論：成功構(gòu)建了一種非病毒siRNA遞送載體系統(tǒng),為未來實現(xiàn)siRNA局部給藥開辟了一條可行的途徑。
【關(guān)鍵詞】：siRNA遞送 層層自組裝 殼聚糖-siRNA-透明質(zhì)酸(CHS-siRNA-HA)多層薄膜 基因沉默效應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R943
【目錄】：

• 內(nèi)容摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 緒論13-28
• 1.1 層層自組裝技術(shù)與生物超薄膜筑建概論13-15
• 1.1.1 層層自組裝技術(shù)制備生物超薄膜13
• 1.1.2 多層生物薄膜的表征手段13-15
• 1.2 siRNA的研究現(xiàn)狀15-26
• 1.2.1 RNA干擾(RNAi)技術(shù)15-17
• 1.2.2 siRNA藥物的臨床最新進展17-19
• 1.2.3 siRNA體內(nèi)遞送的障礙19-20
• 1.2.4 非病毒siRNA載體應(yīng)具備的性質(zhì)20
• 1.2.5 常用非病毒siRNA藥物載體的研究現(xiàn)狀20-26
• 1.3 本課題研究目的和意義、研究內(nèi)容26-28
• 1.3.1 本課題的目的及意義26-27
• 1.3.2 本課題的研究內(nèi)容27-28
• 第二章 殼聚糖-siRNA-透明質(zhì)酸LBL薄膜的制備及表征28-43
• 2.1 實驗原料與器材28-30
• 2.1.1 實驗原料28
• 2.1.2 實驗器材28-29
• 2.1.3 相關(guān)溶液的配制29-30
• 2.2 實驗方法30-33
• 2.2.1 殼聚糖-siRNA-透明質(zhì)酸LBL超薄膜的制備30-31
• 2.2.2 多層薄膜組裝過程的驗證31
• 2.2.3 多層薄膜制備的影響因素探討31-32
• 2.2.4 多層薄膜的結(jié)構(gòu)和形貌表征32-33
• 2.3 實驗結(jié)果與分析33-42
• 2.3.1 UV-vis吸收光譜分析33-36
• 2.3.2 FTIR光譜分析36-39
• 2.3.3 ~(13)C-NMR波譜分析39-41
• 2.3.4 原子力顯微鏡測試(AFM)41-42
• 2.4 實驗小結(jié)42-43
• 第三章 殼聚糖-siRNA-透明質(zhì)酸LBL薄膜的緩釋性能43-50
• 3.1 實驗試劑與器材43-44
• 3.1.1 實驗試劑43-44
• 3.1.2 實驗器材44
• 3.2 實驗方法44-46
• 3.2.1 siRNA多層薄膜在不同溶液中的緩釋性能探索44
• 3.2.2 多層薄膜釋放siRNA的基因完整性驗證44-46
• 3.3 實驗結(jié)果及分析46-49
• 3.3.1 UV-vis驗證薄膜中siRNA藥物的釋放46-48
• 3.3.2 聚丙烯酰胺電泳實驗驗證釋放siRNA基因的完整性48-49
• 3.4 本章小結(jié)49-50
• 第四章 殼聚糖-siRNA-透明質(zhì)酸薄膜的基因沉默效應(yīng)評價50-56
• 4.1 材料與方法50-52
• 4.1.1 細胞培養(yǎng)50-51
• 4.1.2 細胞轉(zhuǎn)染51-52
• 4.2 試驗結(jié)果與分析52-55
• 4.2.1 多層薄膜的基因沉默效應(yīng)分析52-54
• 4.2.2 統(tǒng)計結(jié)果54-55
• 4.3 實驗小結(jié)55-56
• 第五章 全文總結(jié)與展望56-59
• 5.1 結(jié)論56-57
• 5.1.1 殼聚糖-siRNA-透明質(zhì)酸LBL薄膜的制備及表征56
• 5.1.2 殼聚糖-siRNA-透明質(zhì)酸LBL薄膜的緩釋性能探索56-57
• 5.1.3 殼聚糖-siRNA-透明質(zhì)酸LBL薄膜的基因沉默效應(yīng)評價57
• 5.2 論文創(chuàng)新點及進一步拓展57-59
• 縮略詞59-60
• 參考文獻60-68
• 致謝68-69
• 研究生在讀期間發(fā)表與撰寫的論文69
• 申請的專利69

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本文編號：759531