本文關(guān)鍵詞：微生物羰基還原酶催化法合成磷酸西他列汀關(guān)鍵手性中間體

  更多相關(guān)文章： 生物還原 西他列汀 類產(chǎn)堿假單胞菌XW-40 樹脂原位吸附 固定化

【摘要】：利用生物催化法制備光學活性化合物已經(jīng)成為當今的研究熱點之一。微生物羰基還原酶催化前手性羰基還原合成手性醇,已成為手性藥物及其中間體的重要合成途徑。本文對利用微生物羰基還原酶催化法不對稱還原4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氫[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮(2)合成抗Ⅱ型糖尿病藥物磷酸西他列汀關(guān)鍵手性中間體(S)-3-羥基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氫[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-4-(2,4,5-,三氟苯基)丁-1-酮((S)-1)進行了研究,實現(xiàn)了(S)-1高效、高對映選擇性的制備。采用分級篩選模型,從125份土壤樣品中分離出能夠以苯乙酮為唯一碳源生長的89個菌株。其中24個菌株能夠?qū)⑶笆中酝?還原為1。編號為40-1的菌株表現(xiàn)出最高的羰基還原酶活性和對映選擇性,被選為后續(xù)研究的目標菌株。該菌株經(jīng)16S rDNA序列比對分析,將其鑒定為Pseudomonas pseudoalcaligenes,命名為類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)XW-40。利用響應(yīng)面與單因素法對類產(chǎn)堿假單胞菌XW-40產(chǎn)羰基還原酶的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。得出最佳培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件為:D-果糖13 g/L,牛肉膏11.2 g/L,蛋白胨28 g/L,NaCl 4.6 g/L,MgSO4?7H2O 1.2 g/L,KH2PO4 1.0 g/L,pH為7.0,培養(yǎng)溫度為30℃,搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min,培養(yǎng)時間為36 h。在優(yōu)化的條件下,類產(chǎn)堿假單胞菌XW-40菌株所產(chǎn)的羰基還原酶活力達326 U/g(干重細胞),較優(yōu)化前提高了23%。通過對該菌株還原2制備(S)-1工藝的優(yōu)化,確定最佳的底物濃度為10 g/L,細胞濃度為80 g(干重)/L,輔底物為5%(w/v)葡萄糖,助溶劑為10%(v/v)DMSO;最佳pH為7.0,溫度為30℃,搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min,反應(yīng)時間為24 h。在最佳條件下反應(yīng),產(chǎn)率99%,ee值99%。進一步對細胞的重復利用進行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個批次后的收率仍為47%,即在1L的反應(yīng)體系中使用同一批次的細胞,可以生成的產(chǎn)物量高達37.4 g。為了提高底物的初始濃度與減少反應(yīng)中底(產(chǎn))物對羰基還原酶的抑制作用,采用樹脂原位吸附技術(shù),將底物先吸附于大孔樹脂XAD-7上再加入反應(yīng)體系進行轉(zhuǎn)化。使用此樹脂原位吸附策略,使得底物初始濃度由10 g/L提高至25 g/L,反應(yīng)45 h后,產(chǎn)率為90.5%,ee值99%。為提高生物催化劑的穩(wěn)定性,對類產(chǎn)堿假單胞菌XW-40細胞的海藻酸鈉包埋固定化工藝進行了初步研究。得到最佳的固定化條件為:海藻酸鈉濃度為1.5%(w/v),CaCl2的濃度為3%(w/v),細胞的包埋濃度為16%(w/v),固定化時間為6 h。采用在此最佳條件制得的固定化細胞進行還原2合成(S)-1的反應(yīng),底物的濃度為10 g/L,細胞終濃度80 g/L,反應(yīng)時間35 h,產(chǎn)率為98.8%,ee值99%。
【關(guān)鍵詞】：生物還原 西他列汀 類產(chǎn)堿假單胞菌XW-40 樹脂原位吸附 固定化
【學位授予單位】：重慶郵電大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R914.5
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第1章 緒論10-21
• 1.1 糖尿病與糖尿病藥物簡介10
• 1.2 西他列汀10-14
• 1.2.1 西他列汀化學名與結(jié)構(gòu)10-11
• 1.2.2 西他列汀作用機理11
• 1.2.3 西他列汀的合成11-14
• 1.3 生物催化及其在手性藥物合成中的應(yīng)用14-19
• 1.3.1 手性與生物催化14-15
• 1.3.2 羰基還原酶15-19
• 1.4 本課題的研究意義與主要內(nèi)容19-21
• 1.4.1 研究意義19
• 1.4.2 研究主要內(nèi)容19-21
• 第2章 產(chǎn)羰基還原酶菌株的篩選與鑒定21-29
• 2.1 前言21
• 2.2 實驗材料21-23
• 2.2.1 實驗試劑與儀器21-22
• 2.2.2 土壤樣品來源22
• 2.2.3 培養(yǎng)基22-23
• 2.3 實驗方法23-25
• 2.3.1 菌株初篩與分離23
• 2.3.2 菌株復篩23-24
• 2.3.3 菌株鑒定24-25
• 2.4 結(jié)果與討論25-27
• 2.4.1 菌株的初篩25
• 2.4.2 菌株的復篩25-26
• 2.4.3 菌株 40-116S rDNA鑒定結(jié)果26-27
• 2.4.4 系統(tǒng)進化樹27
• 2.5 本章小結(jié)27-29
• 第3章 類產(chǎn)堿假單胞菌XW-40菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化29-42
• 3.1 前言29
• 3.2 實驗材料與儀器29-30
• 3.3 實驗方法30-32
• 3.3.1 酶活力的測定30
• 3.3.2 類產(chǎn)堿假單胞菌XW-40產(chǎn)羰基還原酶的培養(yǎng)基優(yōu)化30-31
• 3.3.3 類產(chǎn)假堿單胞菌XW-40產(chǎn)羰基還原酶的培養(yǎng)條件優(yōu)化31-32
• 3.4 實驗結(jié)果與討論32-41
• 3.4.1 類產(chǎn)堿假單胞菌XW-40產(chǎn)羰基還原酶的培養(yǎng)基優(yōu)化32-38
• 3.4.2 類產(chǎn)堿假單胞菌XW-40產(chǎn)羰基還原酶的培養(yǎng)條件優(yōu)化38-41
• 3.5 本章小結(jié)41-42
• 第4章 類產(chǎn)堿假單胞菌XW-40不對稱還原制備(S)-1 轉(zhuǎn)化條件的研究42-52
• 4.1 前言42
• 4.2 實驗材料與儀器42
• 4.3 實驗方法42-45
• 4.3.1 細胞培養(yǎng)與靜息細胞制備42-43
• 4.3.2 HPLC條件43
• 4.3.3 催化反應(yīng)條件的優(yōu)化43-44
• 4.3.4 批次反應(yīng)44
• 4.3.5 制備規(guī)模生物還原反應(yīng)44-45
• 4.4 結(jié)果與討論45-51
• 4.4.1 水溶性輔溶劑對反應(yīng)的影響45-46
• 4.4.2 pH對反應(yīng)的影響46
• 4.4.3 溫度對反應(yīng)的影響46-47
• 4.4.4 底物濃度對反應(yīng)的影響47-48
• 4.4.5 細胞濃度對反應(yīng)的影響48
• 4.4.6 輔底物對反應(yīng)的影響48-50
• 4.4.7 催化還原2合成(S)-1 的時間歷程的研究50
• 4.4.8 批次反應(yīng)50-51
• 4.5 本章小結(jié)51-52
• 第5章 樹脂原位吸附與細胞包埋固定化的研究52-65
• 5.1 前言52-53
• 5.2 實驗材料與儀器53-54
• 5.3 實驗方法54-57
• 5.3.1 樹脂原位吸附54-55
• 5.3.2 海藻酸鈉包埋法固定化類產(chǎn)堿假單胞菌XW-40的研究55-57
• 5.4 結(jié)果與討論57-63
• 5.4.1 樹脂原位吸附57-60
• 5.4.2 海藻酸鈉包埋法固定化類產(chǎn)堿假單胞菌XW-40細胞制備條件的優(yōu)化60-63
• 5.5 本章小結(jié)63-65
• 第6章 總結(jié)與展望65-67
• 6.1 總結(jié)65-66
• 6.2 展望66-67
• 參考文獻67-73
• 附錄A 部分HPLC圖譜73-75
• 附錄B 供試菌株 40-116S rDNA序列與Pseudomonas pseudoalcaligenes strain2-3(HQ285878.1)序列比對結(jié)果75-77
• 附錄C 1H NMR與 13C NMR譜圖77-78
• 致謝78-79
• 攻讀碩士學位期間從事的科研工作及取得的成果79

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 吳婷;劉媛;東鴻鑫;夏超;石金城;;2型糖尿病治療藥西他列汀的合成研究[J];中國新藥雜志;2015年21期

2 石小丹;李嘯;張松;羅宇笛;談亞麗;;均勻設(shè)計法優(yōu)化重組大腸桿菌產(chǎn)酮基還原酶培養(yǎng)基[J];天津農(nóng)業(yè)科學;2015年06期

3 張航;陳曦;馮進輝;鮑錦庫;吳洽慶;朱敦明;;高通量篩選具有催化活性和立體選擇性羰基還原酶[J];生物工程學報;2015年02期

4 薛芳;李紅梅;黃艷青;高露嬌;侯立琪;;響應(yīng)面-滿意度函數(shù)優(yōu)化產(chǎn)羰基還原酶工程菌發(fā)酵條件[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2015年02期

5 舒學香;孫麗慧;鄭裕國;;羰基還原酶產(chǎn)生菌Candida sorboxylosa的篩選與產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J];工業(yè)微生物;2013年05期

6 郁惠蕾;黃磊;倪燕;許國超;許建和;;羰基生物還原法合成手性醇的研究進展[J];生物加工過程;2013年03期

7 柳英帥;王巖萍;郭錦材;張興賢;;抗2型糖尿病藥西他列汀關(guān)鍵手性中間體的合成研究[J];中國藥物化學雜志;2012年05期

8 楊鳳萍;許善峰;沈云霞;王愛勤;楊生妹;;微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)度洛西汀中間體手性醇菌株的鑒定[J];微生物學通報;2012年02期

9 宮緒敏;聶堯;徐巖;肖榮;Gaetano T.MONTELIONE;;羰基還原酶輔酶結(jié)合域位點突變對其不對稱催化性能的影響[J];催化學報;2012年02期

10 歐玲;謝諺;許建和;;還原酶催化羰基不對稱還原的應(yīng)用進展[J];生物加工過程;2011年02期

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本文編號：727337