本文關(guān)鍵詞：心臟特異性CYP2E1基因修飾小鼠在毒理學(xué)評價中的應(yīng)用保健食品中含蒽醌類成分中藥原料的安全性評價

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【摘要】：背景 藥物的毒性反應(yīng)是非臨床安全性評價的主要研究內(nèi)容,其中高達26%的毒性反應(yīng)是心血管毒性。目前,外源性藥物導(dǎo)致心臟毒性的作用機制主要有氧化應(yīng)激反應(yīng)、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和免疫炎癥反應(yīng)等。CYP2E1是機體參與內(nèi)外源性物質(zhì)催化作用的一類重要的氧化代謝酶,同時產(chǎn)生活性氧自由基(reactive oxygen free radi cal, ROS),引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和細胞凋亡等過程,進而對機體產(chǎn)生毒性。人源化CYP2E1基因修飾小鼠,為研究人CYP2E1基因表達調(diào)控和功能提供了完整的生物遺傳系統(tǒng),國內(nèi)外許多研究已將其應(yīng)用于CYP2E1的代謝機制以及與CYP2E1基因有關(guān)的疾病如脂肪性肝病的病理機制研究中。本實驗選用兩種心臟特異性CYP2E1基因修飾小鼠(心臟特異性CYP2E1轉(zhuǎn)基因小鼠,a-MHC CYP2E 1 transgenic mice, Tg(+)和心臟特異性CYP2E1基因沉默小鼠,a-MHC CYP2E1 silence mice, sTg(+)),來進行CYP2E1基因的特異性底物--對乙酰氨基酚以及具有潛在心臟毒性藥物--西布曲明的毒性評價的初步探索,以期選擇一種敏感性更高的基因修飾動物模型,為具有潛在心臟毒性藥物的非臨床安全性評價尋找一種更加快速、靈敏、準(zhǔn)確的動物模型。方法(1)兩種心臟特異性CYP2E1基因修飾小鼠(Tg(+)和sTg(+))的繁殖及鑒定：PCR鑒定心臟特異性CYP2E1基因修飾小鼠的基因型,分別篩選出Tg(+)和sTg(+)小鼠進行繁殖培育并用于本實驗。(2)對乙酰氨基酚的急性毒性評價預(yù)試驗：8周齡雄性Tg(+)型小鼠、sTg(+)型小鼠、野生型C57BL/6小鼠(WT),各50只,分別隨機分成2組,每組10只,溶媒對照組(灌胃給予純凈飲用水)及1個實驗組(300 mg/kg對乙酰氨基酚)。給藥過程中進行一般癥狀觀察；給藥3d后取血并解剖取心臟、肝臟、腎臟,測定各組實驗小鼠血生化心臟功能指標(biāo)(乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB))、肝功能指標(biāo)(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬門氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)),腎臟功能指標(biāo)(尿素(UN)、肌酐(CREA)),以及血常規(guī)指標(biāo)；測定心臟、肝臟、腎臟臟器系數(shù)結(jié)果；并進行病理組織學(xué)檢查。(3)西布曲明毒性評價：8周齡雄性Tg(+)型小鼠、sTg(+)型小鼠、野生型C57BL/6小鼠(WT),各50只,分別隨機分成5組,每組10只,溶媒對照組(灌胃給予純凈飲用水)及4個實驗組(50、100、150、300 mg/kg西布曲明)。給藥過程中進行一般癥狀觀察以及存活率的測定；給藥15d后取血并解剖取心臟、肝臟、腎臟,測定各組實驗小鼠血生化心臟功能指標(biāo)(乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB))、肝功能指標(biāo)(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬門氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)),腎臟功能指標(biāo)(尿素(UN)、肌酐(CREA)):測定各臟器系數(shù)結(jié)果；并進行病理組織學(xué)檢查,以及用免疫組織化學(xué)方法觀察心臟組織縫隙蛋白43(connexin 43, CX43)的表達情況。結(jié)果(1)對乙酰氨基酚的急性毒性預(yù)試驗：1)血生化指標(biāo)顯示,Tg(+)和WT型小鼠給藥組的肝功能指標(biāo)(ALT、AST、 ALP)、心功能指標(biāo)(CK、 LDH、 CK-MB)均不同程度地顯著高于其溶媒對照組(P0.05或P0.01),其中WT型小鼠的肝功能指標(biāo)(ALT、 AST、 ALP)升高程度最大(P0.01),而sTG(±)型小鼠的心功能指標(biāo)(CK、 CK-MB)的數(shù)值卻是降低的(P0.05)。2)病理組織學(xué)結(jié)果顯示,Tg(+)、 sTg(+)和WT型三種小鼠的給藥組均表現(xiàn)出肝臟病理變化。(2)西布曲明毒性評價：1)血生化指標(biāo)顯示,在給藥劑量50 mg/kg和100 mg/kg時,Tg(+)型小鼠的心功能指標(biāo)(CK、 LDH、 CK-MB)均顯著高于WT型小鼠(P0.05或P0.01)：在給藥劑量50、100和150 mg/kg時,Tg(+)型小鼠的心功能指標(biāo)(CK、LDH、 CK-MB)均顯著高于sTg(+)型小鼠(P0.05或P0.01)；而在給藥劑量300 mg/kg時,Tg(±)型小鼠的心功能指標(biāo)(CK、LDH、 CK-MB)均顯著低于WT和sTg(+)型小鼠(P0.05或P0.01),且sTg(+)型小鼠減小的程度最小。2)病理組織學(xué)結(jié)果顯示,Tg(+)和WT型小鼠各個給藥組均表現(xiàn)出心臟損傷的跡象。3)免疫組織化學(xué)染色顯示,隨著給藥劑量的加大,Tg(+)、 sTg(+)和WT型三種小鼠CX43在心肌細胞閏盤處的表達數(shù)量均逐漸下降,且染色顏色逐漸變淺；而CX43在心肌細胞閏盤處的表達數(shù)量下降程度和染色顏色變淺程度由高到低分別為,Tg(+)型小鼠,其次是WT型小鼠,sTg(+)型小鼠。結(jié)論Tg(+)型小鼠在評價藥物潛在心臟毒性試驗中可能比WT型小鼠具有更高的敏感性,而sTg(+)型小鼠則相反,可能是一個很好的心臟毒性保護模型。背景決明子(Cassiae Semen)為豆科植物或小決明的干燥成熟種子,是一味具有清熱明目、利水通便等功效的中草藥�，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,決明子具有降壓、調(diào)脂、保肝等作用,常用于治療高血脂、高血壓、便秘等疾病,并被納入衛(wèi)生部頒布的“藥食同源名單”中。決明子的主要成分是蒽醌類化合物(如大黃素、大黃酚、大黃酸等),其在表現(xiàn)出廣泛藥理作用的同時,也表現(xiàn)出多種毒副作用。為了研究中藥決明子原料藥的毒性,我們進行了大鼠經(jīng)口灌胃給予不同劑量的決明子6個月及恢復(fù)期,觀察出現(xiàn)毒性反應(yīng)的靶器官,闡明長期食用決明子后是否存在肝毒性、腎毒性、腸毒性等安全性隱患。方法試驗選用SPF級SD大鼠240只,雌雄各半。購入體重雄性：80-100g,雌性：80-100g。適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)6天后,按體重和性別隨機分為4組：高(10g生藥/kgBW)、中(2.2g生藥/kgBW、低(0.5g生藥/kgBW3個劑量組和一個對照組(純水)。給藥體積：1.0m1/100g。給藥頻率采用每周給藥6天,每天給藥1次,連續(xù)給藥6個月。給藥期間于每天上午和下午各觀察一次動物的一般狀態(tài),定期進行體重和攝食量的測定,在給藥第3、6個月,給藥6個月后恢復(fù)4周,禁食12～1 6小時,分別剖殺20只/組,雌雄各半。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,從腹腔動脈采血進行血液學(xué)、血清生化學(xué)測定,剖檢主要臟器進行臟器重量稱量、計算臟器重量及臟器系數(shù),并對各個劑量組全部臟器進行組織病理學(xué)檢查。結(jié)果1、大鼠連續(xù)灌胃給予決明子三個月、六個月及其恢復(fù)期的試驗周期中,各給藥劑量組及對照組動物給藥前、后一般狀況觀察未見異常,且未發(fā)生因給予決明子藥物本身引起的大鼠瀕死和死亡的毒性反應(yīng)。2、各給藥劑量組及對照組大鼠體重均增長,且(?)與(?)大鼠的增長速度分別依次為：CN組T1組T2組T3組,并呈現(xiàn)出一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系。3、與對照組相比,各給藥劑量組6性大鼠網(wǎng)織紅細胞百分比(RET%)以及總膽紅素(TBIL)偏低,且恢復(fù)4周后,網(wǎng)織紅細胞百分比(RET%)恢復(fù)正常,但T3組(?)大鼠的總膽紅素(TBIL)依舊偏低。4、T2、T3組6性大鼠的腎臟系數(shù)均不同程度地顯著性高于對照組(P0.05或P0.01)。5、連續(xù)灌胃決明子六個月后,在T1組和T2組劑量下大鼠未出現(xiàn)與供試品有關(guān)的毒理學(xué)改變,但在T3組劑量下可引起大鼠腎臟近曲小管上皮細胞內(nèi)色素沉積,并可能引起腎小管萎縮及再生,且上述現(xiàn)象在恢復(fù)4周后雖有所緩解,但仍存在。結(jié)論在本試驗室條件下,SD大鼠連續(xù)灌胃決明子六個月,在T3組劑量下出現(xiàn)毒性的靶器官是腎臟,而T1組和T2組未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：細胞色素P450 2E1 基因修飾 對乙酰氨基酚 西布曲明 藥物毒性 決明子 凍干粉 蒽醌 長期毒性試驗
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R994.4
【目錄】：

• 第一部分 心臟特異性CYP2E1基因修飾小鼠在毒理學(xué)評價中的應(yīng)用4-41
• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-8
• 前言8-14
• 材料和方法14-20
• 實驗結(jié)果20-34
• 討論34-36
• 結(jié)論36-37
• 參考文獻37-41
• 第二部分 保健食品中含蒽醌類成分中藥原料的安全性評價41-74
• 中文摘要41-42
• 英文摘要42-44
• 前言44-47
• 材料和方法47-51
• 實驗結(jié)果51-71
• 討論71-72
• 結(jié)論72-73
• 參考文獻73-74
• 個人簡歷74-75
• 英文縮略表75-78
• 致謝78-79

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本文編號：703172