本文關鍵詞：1、抗腫瘤藥物海鞘多肽CS5931的表達及分離純化研究 2、轉基因棉花治理土壤重金屬污染的研究

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【摘要】：從薩氏海鞘(Cionasavignyi)中我們分離出了一種新型的具有抗腫瘤活性的多肽,即CS5931,其分子量為5931Da。實驗表明,CS5931可以抑制多種癌細胞的生長,可以對人類肝癌細胞BEL-7402進行誘導從而使癌細胞死亡。N-末端序列的分析結果表明,CS5931與人類顆粒體蛋白(granulin, GRN)具有同源性。早期利用分子生物學技術,實驗室成功克隆了編碼多肽CS5931全長cDNA序列,并因此獲得了CS593 1的氨基酸序列,此外還通過基因工程技術對該氨基酸序列進行了重組表達。本研究采用親和層析法,來獲得高純度的重組多肽CS5931,后期將對該重組多肽進行分子機制及其抗腫瘤活性的研究。我們在實驗中將編碼多肽CS5931的基因片段連接到了表達載體pET21a(+)上從而構建了表達載體pET21a(+)-CS5931,并且通過將載體轉入到含有分子伴侶質粒pG-KJE8的Origami(DE3)中構建了表達體系Origami/pET21a(+)-CS5931+ pG-KJE8,我們對該表達體系進行了誘導并得到了含硫氧還蛋白標簽的表達產物重組多肽CS5931-His,且表達產物為可溶性蛋白。隨后經變性純化、復性和蛋白酶酶切,我們得到了純度不小于95%的帶有His-tag的重組多肽CS5931-HiS。重組多肽CS5931-His的His標簽位于C-末端,在宿主菌種中的表達形式主要是可溶性形式表達。本課題表明,收集菌體裂解液上清液(含有可溶性表達蛋白),在變性的條件下,經鎳離子親和層析柱親和、用濃度為50 mM的咪唑洗去雜蛋白,并用濃度為500mM的咪唑洗脫,三步即可獲得純化的重組多肽CS5931-His。重組多肽CS5931-His對癌細胞生長的抑制作用通過MTT法進行了評價。結果顯示,CS5931-His對人類宮頸腫瘤細胞Hela、人類結腸腫瘤細胞HCT116和RKO、人類白血病細胞HL60以及人類肺癌腫瘤細胞A549均有較不錯的增殖抑制作用。本課題對開發(fā)海洋多肽類抗腫瘤新藥具有非常重要的價值,而且對建立Enolase 1作為抗腫瘤藥物的新靶標也具有重要的意義。2014年3月,民進中央在在全國政協(xié)十二屆二次會議上提交了關于利用非食用作物修復重金屬污染土壤的提案,提案中指出,針對現(xiàn)在我國土壤重金屬污染越來越嚴重的問題,可以利用非食用經濟作物,如苧麻、棉花等,工業(yè)用油料作物如海甘藍、蓖麻等,以及其它非食用作物,通過吸收并富集作用將重金屬移出土壤,從而達到污染治理與生態(tài)恢復的目的,這一提案在修復效果和經濟效益方面都具有優(yōu)勢明顯,并且同時兼有經濟效益和環(huán)境效益,易于被接受和推廣。棉花是世界上最主要的農作物之一,其產量大而且生產成本低,我國的棉花種植面積基本在500萬公頃左右(約合7500萬畝),棉花的產量在700萬噸左右。長江流域、黃河流域和西北內陸棉區(qū)是我國三大棉區(qū),具體包括冀、魯、豫、陜、晉、津、蘇、皖、湘、鄂、贛、新、甘等13個省區(qū)。因此,我們選用棉花處理土壤重金屬污染具有極大的便利性和可行性。本實驗將來自香港大學的ACBP1基因轉化至農桿菌LBA4404中,然后利用農桿菌介導法將該基因轉入棉花。使棉花的抗重金屬能力大大增強,從而起到治理重金屬污染的土壤。實驗主要探究了農桿菌介導方法以及棉花再生體系的建立。實驗選取“石抗434”“大德”“石雜101”三種棉花,最終選定以“石抗”的下胚軸作為基因轉化的受體,對愈傷組織培養(yǎng)條件優(yōu)化,篩選出胚性愈傷組織出愈率高的條件,針對各時期愈傷組織培養(yǎng)的特定需要,考察了碳源、瓊脂、不同的激素配比、抗褐化劑等因素,進而優(yōu)化了適合“石抗434”的遺傳轉化再生體系。
【關鍵詞】：多肽 抗腫瘤 基因表達 分離純化 棉花 重金屬污染 植物修復 ACBP1基因
【學位授予單位】：青島科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：O629.72;R945
【目錄】：

• 第一篇 抗腫瘤藥物海鞘多肽CS593的表達及分離純化研究3-56
• 摘要3-4
• ABSTRACT4-13
• 第一章 文獻綜述13-20
• 1.1 多肽類藥物的抗腫瘤研究進展13-15
• 1.1.1 抗腫瘤多肽的來源13-15
• 1.1.2 抗腫瘤多肽的發(fā)展瓶頸15
• 1.2 海鞘抗腫瘤藥物的作用機制與研究進展15-17
• 1.3 CS5931的分離技術-親和層析技術的研究進展17-19
• 1.3.1 親和層析的類型17
• 1.3.2 固定化金屬離子親和層析17-19
• 1.3.2.1 固定化金屬離子親和層析的基本原理17-18
• 1.3.2.2 固定化金屬離子親和層析柱的制法18
• 1.3.2.3 固定化金屬離子親和層析的優(yōu)點18
• 1.3.2.4 金屬螯合親和層析分離純化變性蛋白18-19
• 1.4 本課題研究的目的和意義19-20
• 第二章 抗腫瘤多肽CS5931的克隆20-34
• 2.1 實驗材料20-23
• 2.1.1 實驗用薩氏海鞘20-21
• 2.1.2 質粒與菌株21
• 2.1.3 引物21
• 2.1.4 實驗設備21-22
• 2.1.5 實驗試劑22
• 2.1.6 相關溶液的配制22-23
• 2.2 實驗方法23-29
• 2.2.1 薩氏海鞘總RNA的提取23
• 2.2.2 3'RACE23-25
• 2.2.3 5'RACE25-28
• 2.2.4 PCR產物膠回收28
• 2.2.5 PCR產物與克隆載體的連接和轉化28-29
• 2.2.6 測序、生物信息學分析和3D模型預測29
• 2.3 實驗結果29-32
• 2.3.1 薩氏海鞘總RNA的質量分析29-30
• 2.3.2 編碼多肽CS5931基因的cDNA3'和5'末端片段的分離30
• 2.3.3 編碼多肽CS5931的基因的克隆30-31
• 2.3.4 編碼多肽CS5931的基因的序列分析31-32
• 2.4 分析與討論32-34
• 第三章 抗腫瘤多肽CS5931的表達34-46
• 3.1 實驗材料34-37
• 3.1.1 質粒與菌株34-35
• 3.1.2 培養(yǎng)基35
• 3.1.3 引物35
• 3.1.4 實驗設備35
• 3.1.5 實驗試劑35-36
• 3.1.6 相關溶液的配制36-37
• 3.2 實驗方法37-42
• 3.2.1 原核表達載體的構建37-39
• 3.2.2 大腸桿菌(E.COLI)ORIGAMI(DE3)感受態(tài)細胞的制備39-40
• 3.2.3 重組載體的轉化40
• 3.2.4 重組多肽CS5931在大腸桿菌中的誘導表達和檢測40-42
• 3.2.4.1 重組多肽CS5931的誘導表達40-41
• 3.2.4.2 可溶性表達情況檢測41-42
• 3.2.5 表達條件的確定42
• 3.3 實驗結果42-44
• 3.3.1 重組多肽CS5931-HIS的誘導表達情況42-43
• 3.3.2 重組多肽CS5931-HIS的表達形式分析43-44
• 3.3.3 重組多肽CS5931-HIS的表達條件44
• 3.4 分析和討論44-46
• 第四章 抗腫瘤多肽CS5931的分離、純化與凍干46-52
• 4.1 實驗材料46-47
• 4.1.1 儀器和設備46-47
• 4.1.2 實驗試劑47
• 4.1.3 相關溶液的配制47
• 4.2 實驗方法47-50
• 4.2.1 重組蛋白在變性條件下的純化47-48
• 4.2.2 重組蛋白CS5931-HIS的復性48
• 4.2.3 BCA法測定重組多肽的濃度48-49
• 4.2.4 MTT法測蛋白活性49
• 4.2.5 超聲波破碎的時間確定49
• 4.2.6 鎳離子親和層析洗滌液和洗脫液中咪唑濃度的確定49-50
• 4.2.7 凍干方法的改善50
• 4.3 實驗結果50-51
• 4.3.1 超聲波破碎時間的選擇50
• 4.3.2 鎳離子親和層析洗滌液和洗脫液中咪唑濃度的確定50-51
• 4.3.3 超濾離心濃縮蛋白溶液對凍干蛋白活性的影響51
• 4.4 分析和討論51-52
• 結論52-53
• 參考文獻53-56
• 第二篇 轉基因棉花治理土壤重金屬污染的研究56-104
• 摘要56-57
• ABSTRACT57-61
• 第一章 文獻綜述61-74
• 1.1 土壤重金屬污染情況以及危害61-62
• 1.2 重金屬污染土壤的治理方法62-64
• 1.3 轉基因植物修復被污染的土壤的研究進展64-65
• 1.4 植物轉基因的方法65-67
• 1.4.1 農桿菌介導法65-66
• 1.4.2 基因槍法66
• 1.4.3 花粉管導入法66-67
• 1.4.4 其他方法67
• 1.5 棉花植物組織培養(yǎng)現(xiàn)狀67-72
• 1.5.1 體細胞胚胎發(fā)生67-71
• 1.5.1.1 影響體細胞胚胎發(fā)生的因素67-69
• 1.5.1.2 胚性愈傷組織的形成和培養(yǎng)69
• 1.5.1.3 體細胞胚的萌發(fā)和成熟69-71
• 1.5.2 器官發(fā)生71-72
• 1.6 課題的研究目的和意義72-74
• 第二章 含ACBP1基因質粒農桿菌的轉化74-84
• 2.1 實驗材料74-78
• 2.1.1 菌種及質粒74-75
• 2.1.2 儀器和設備75
• 2.1.3 實驗試劑及溶液的配制75-77
• 2.1.3.1 實驗試劑75-77
• 2.1.3.2 主要溶液的配制77
• 2.1.4 主要培養(yǎng)基成分和配制方法77-78
• 2.1.5 酶及引物78
• 2.2 實驗方法78-81
• 2.2.1 質粒轉化大腸桿菌78-79
• 2.2.2 質粒DNA的小量提取(質粒小提取試劑盒法)79-80
• 2.2.3 瓊脂糖凝膠電泳80
• 2.2.4 質粒轉化農桿菌LBA440480-81
• 2.3 實驗結果81-82
• 2.3.1 質粒的提取81
• 2.3.2 質粒轉化大腸桿菌與農桿菌的卡那霉素抗性篩選81-82
• 2.3.3 質粒轉化農桿菌LBA440482
• 2.3.3.1 瓊脂糖凝膠電泳82
• 2.3.3.2 質粒DNA測序鑒定82
• 2.4 分析與討論82-84
• 2.4.1 農桿菌轉化系統(tǒng)的優(yōu)點82-84
• 第三章 農桿菌介導ACBP1基因轉化棉花84-100
• 3.1 實驗材料85-88
• 3.1.1 外植體材料85
• 3.1.2 儀器及設備85
• 3.1.3 主要溶液的配制85-88
• 3.2 實驗方法88-92
• 3.2.1 無菌苗的獲得88
• 3.2.2 愈傷組織的誘導88-89
• 3.2.2.1 棉花品種的選擇88
• 3.2.2.2 基礎培養(yǎng)基種類對棉花愈傷誘導的影響88-89
• 3.2.2.3 激素的選擇89
• 3.2.2.4 不同碳源對愈傷組織誘導的影響89
• 3.2.2.5 棉花愈傷組織的防褐化研究89
• 3.2.3 農桿菌介導的基因轉化89-91
• 3.2.3.1 預培養(yǎng)對轉化的影響90
• 3.2.3.2 農桿菌菌液濃度和浸染時間對出愈率的影響90
• 3.2.3.3 共培養(yǎng)時間對轉化效率的影響90
• 3.2.3.4 愈傷組織的脫菌處理90-91
• 3.2.4 愈傷組織的生芽誘導91
• 3.2.4.1 培養(yǎng)基性質(液體、固體)對誘導生芽的影響91
• 3.2.4.2 碳源對誘導生芽的影響91
• 3.2.4.3 赤霉素對生芽的影響91
• 3.2.4.4 AC、AgNO_3的添加對生芽的影響91
• 3.2.5 生根誘導91-92
• 3.2.5.1 培養(yǎng)基性質對生根的影響91
• 3.2.5.2 不同碳源對生根的影響91
• 3.2.5.3 谷氨酰胺對生根的影響91-92
• 3.3 實驗結果92-99
• 3.3.1 無菌苗的獲得92-93
• 3.3.2 愈傷組織的誘導93-96
• 3.3.2.1 棉花品種的選擇93-94
• 3.3.2.2 培養(yǎng)基的選擇94
• 3.3.2.3 激素水平對愈傷組織誘導的影響94-95
• 3.3.2.4 棉花愈傷組織的防褐化研究95-96
• 3.3.3 農桿菌介導的基因轉化96-98
• 3.3.3.1 預培養(yǎng)對共轉化效率的影響96-97
• 3.3.3.2 菌液濃度和浸染時間對轉化情況的影響97
• 3.3.3.3 共培養(yǎng)時間對愈傷組織的影響97
• 3.3.3.4 愈傷組織的脫菌處理97-98
• 3.3.4 愈傷組織的生芽誘導98
• 3.3.4.1 培養(yǎng)基性質對愈傷生芽的影響98
• 3.3.4.2 不同碳源對生芽的影響98
• 3.3.4.3 赤霉素對生芽的影響98
• 3.3.4.4 AC、AgNO_3的添加對生芽的影響98
• 3.3.5 生根誘導98-99
• 3.3.5.1 培養(yǎng)基性質對生根的影響98
• 3.3.5.2 不同碳源對生根的影響98-99
• 3.3.5.3 谷氨酰胺對生根的影響99
• 3.4 分析與討論99-100
• 結論100-101
• 參考文獻101-104
• 致謝104-105
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄105-106

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1 高天虹;1、抗腫瘤藥物海鞘多肽CS5931的表達及分離純化研究 2、轉基因棉花治理土壤重金屬污染的研究[D];青島科技大學;2015年

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