本文關(guān)鍵詞：1、抗腫瘤藥物海鞘多肽CS5931的表達(dá)及分離純化研究 2、轉(zhuǎn)基因棉花治理土壤重金屬污染的研究

  更多相關(guān)文章： 多肽 抗腫瘤 基因表達(dá) 分離純化 棉花 重金屬污染 植物修復(fù) ACBP1基因

【摘要】：從薩氏海鞘(Cionasavignyi)中我們分離出了一種新型的具有抗腫瘤活性的多肽,即CS5931,其分子量為5931Da。實(shí)驗(yàn)表明,CS5931可以抑制多種癌細(xì)胞的生長,可以對人類肝癌細(xì)胞BEL-7402進(jìn)行誘導(dǎo)從而使癌細(xì)胞死亡。N-末端序列的分析結(jié)果表明,CS5931與人類顆粒體蛋白(granulin, GRN)具有同源性。早期利用分子生物學(xué)技術(shù),實(shí)驗(yàn)室成功克隆了編碼多肽CS5931全長cDNA序列,并因此獲得了CS593 1的氨基酸序列,此外還通過基因工程技術(shù)對該氨基酸序列進(jìn)行了重組表達(dá)。本研究采用親和層析法,來獲得高純度的重組多肽CS5931,后期將對該重組多肽進(jìn)行分子機(jī)制及其抗腫瘤活性的研究。我們在實(shí)驗(yàn)中將編碼多肽CS5931的基因片段連接到了表達(dá)載體pET21a(+)上從而構(gòu)建了表達(dá)載體pET21a(+)-CS5931,并且通過將載體轉(zhuǎn)入到含有分子伴侶質(zhì)粒pG-KJE8的Origami(DE3)中構(gòu)建了表達(dá)體系Origami/pET21a(+)-CS5931+ pG-KJE8,我們對該表達(dá)體系進(jìn)行了誘導(dǎo)并得到了含硫氧還蛋白標(biāo)簽的表達(dá)產(chǎn)物重組多肽CS5931-His,且表達(dá)產(chǎn)物為可溶性蛋白。隨后經(jīng)變性純化、復(fù)性和蛋白酶酶切,我們得到了純度不小于95%的帶有His-tag的重組多肽CS5931-HiS。重組多肽CS5931-His的His標(biāo)簽位于C-末端,在宿主菌種中的表達(dá)形式主要是可溶性形式表達(dá)。本課題表明,收集菌體裂解液上清液(含有可溶性表達(dá)蛋白),在變性的條件下,經(jīng)鎳離子親和層析柱親和、用濃度為50 mM的咪唑洗去雜蛋白,并用濃度為500mM的咪唑洗脫,三步即可獲得純化的重組多肽CS5931-His。重組多肽CS5931-His對癌細(xì)胞生長的抑制作用通過MTT法進(jìn)行了評價。結(jié)果顯示,CS5931-His對人類宮頸腫瘤細(xì)胞Hela、人類結(jié)腸腫瘤細(xì)胞HCT116和RKO、人類白血病細(xì)胞HL60以及人類肺癌腫瘤細(xì)胞A549均有較不錯的增殖抑制作用。本課題對開發(fā)海洋多肽類抗腫瘤新藥具有非常重要的價值,而且對建立Enolase 1作為抗腫瘤藥物的新靶標(biāo)也具有重要的意義。2014年3月,民進(jìn)中央在在全國政協(xié)十二屆二次會議上提交了關(guān)于利用非食用作物修復(fù)重金屬污染土壤的提案,提案中指出,針對現(xiàn)在我國土壤重金屬污染越來越嚴(yán)重的問題,可以利用非食用經(jīng)濟(jì)作物,如苧麻、棉花等,工業(yè)用油料作物如海甘藍(lán)、蓖麻等,以及其它非食用作物,通過吸收并富集作用將重金屬移出土壤,從而達(dá)到污染治理與生態(tài)恢復(fù)的目的,這一提案在修復(fù)效果和經(jīng)濟(jì)效益方面都具有優(yōu)勢明顯,并且同時兼有經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益,易于被接受和推廣。棉花是世界上最主要的農(nóng)作物之一,其產(chǎn)量大而且生產(chǎn)成本低,我國的棉花種植面積基本在500萬公頃左右(約合7500萬畝),棉花的產(chǎn)量在700萬噸左右。長江流域、黃河流域和西北內(nèi)陸棉區(qū)是我國三大棉區(qū),具體包括冀、魯、豫、陜、晉、津、蘇、皖、湘、鄂、贛、新、甘等13個省區(qū)。因此,我們選用棉花處理土壤重金屬污染具有極大的便利性和可行性。本實(shí)驗(yàn)將來自香港大學(xué)的ACBP1基因轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌LBA4404中,然后利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該基因轉(zhuǎn)入棉花。使棉花的抗重金屬能力大大增強(qiáng),從而起到治理重金屬污染的土壤。實(shí)驗(yàn)主要探究了農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法以及棉花再生體系的建立。實(shí)驗(yàn)選取“石抗434”“大德”“石雜101”三種棉花,最終選定以“石抗”的下胚軸作為基因轉(zhuǎn)化的受體,對愈傷組織培養(yǎng)條件優(yōu)化,篩選出胚性愈傷組織出愈率高的條件,針對各時期愈傷組織培養(yǎng)的特定需要,考察了碳源、瓊脂、不同的激素配比、抗褐化劑等因素,進(jìn)而優(yōu)化了適合“石抗434”的遺傳轉(zhuǎn)化再生體系。
【關(guān)鍵詞】：多肽 抗腫瘤 基因表達(dá) 分離純化 棉花 重金屬污染 植物修復(fù) ACBP1基因
【學(xué)位授予單位】：青島科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：O629.72;R945
【目錄】：

• 第一篇 抗腫瘤藥物海鞘多肽CS593的表達(dá)及分離純化研究3-56
• 摘要3-4
• ABSTRACT4-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-20
• 1.1 多肽類藥物的抗腫瘤研究進(jìn)展13-15
• 1.1.1 抗腫瘤多肽的來源13-15
• 1.1.2 抗腫瘤多肽的發(fā)展瓶頸15
• 1.2 海鞘抗腫瘤藥物的作用機(jī)制與研究進(jìn)展15-17
• 1.3 CS5931的分離技術(shù)-親和層析技術(shù)的研究進(jìn)展17-19
• 1.3.1 親和層析的類型17
• 1.3.2 固定化金屬離子親和層析17-19
• 1.3.2.1 固定化金屬離子親和層析的基本原理17-18
• 1.3.2.2 固定化金屬離子親和層析柱的制法18
• 1.3.2.3 固定化金屬離子親和層析的優(yōu)點(diǎn)18
• 1.3.2.4 金屬螯合親和層析分離純化變性蛋白18-19
• 1.4 本課題研究的目的和意義19-20
• 第二章 抗腫瘤多肽CS5931的克隆20-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20-23
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)用薩氏海鞘20-21
• 2.1.2 質(zhì)粒與菌株21
• 2.1.3 引物21
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)備21-22
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)試劑22
• 2.1.6 相關(guān)溶液的配制22-23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-29
• 2.2.1 薩氏海鞘總RNA的提取23
• 2.2.2 3'RACE23-25
• 2.2.3 5'RACE25-28
• 2.2.4 PCR產(chǎn)物膠回收28
• 2.2.5 PCR產(chǎn)物與克隆載體的連接和轉(zhuǎn)化28-29
• 2.2.6 測序、生物信息學(xué)分析和3D模型預(yù)測29
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-32
• 2.3.1 薩氏海鞘總RNA的質(zhì)量分析29-30
• 2.3.2 編碼多肽CS5931基因的cDNA3'和5'末端片段的分離30
• 2.3.3 編碼多肽CS5931的基因的克隆30-31
• 2.3.4 編碼多肽CS5931的基因的序列分析31-32
• 2.4 分析與討論32-34
• 第三章 抗腫瘤多肽CS5931的表達(dá)34-46
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料34-37
• 3.1.1 質(zhì)粒與菌株34-35
• 3.1.2 培養(yǎng)基35
• 3.1.3 引物35
• 3.1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)備35
• 3.1.5 實(shí)驗(yàn)試劑35-36
• 3.1.6 相關(guān)溶液的配制36-37
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法37-42
• 3.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建37-39
• 3.2.2 大腸桿菌(E.COLI)ORIGAMI(DE3)感受態(tài)細(xì)胞的制備39-40
• 3.2.3 重組載體的轉(zhuǎn)化40
• 3.2.4 重組多肽CS5931在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)和檢測40-42
• 3.2.4.1 重組多肽CS5931的誘導(dǎo)表達(dá)40-41
• 3.2.4.2 可溶性表達(dá)情況檢測41-42
• 3.2.5 表達(dá)條件的確定42
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-44
• 3.3.1 重組多肽CS5931-HIS的誘導(dǎo)表達(dá)情況42-43
• 3.3.2 重組多肽CS5931-HIS的表達(dá)形式分析43-44
• 3.3.3 重組多肽CS5931-HIS的表達(dá)條件44
• 3.4 分析和討論44-46
• 第四章 抗腫瘤多肽CS5931的分離、純化與凍干46-52
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料46-47
• 4.1.1 儀器和設(shè)備46-47
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑47
• 4.1.3 相關(guān)溶液的配制47
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法47-50
• 4.2.1 重組蛋白在變性條件下的純化47-48
• 4.2.2 重組蛋白CS5931-HIS的復(fù)性48
• 4.2.3 BCA法測定重組多肽的濃度48-49
• 4.2.4 MTT法測蛋白活性49
• 4.2.5 超聲波破碎的時間確定49
• 4.2.6 鎳離子親和層析洗滌液和洗脫液中咪唑濃度的確定49-50
• 4.2.7 凍干方法的改善50
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-51
• 4.3.1 超聲波破碎時間的選擇50
• 4.3.2 鎳離子親和層析洗滌液和洗脫液中咪唑濃度的確定50-51
• 4.3.3 超濾離心濃縮蛋白溶液對凍干蛋白活性的影響51
• 4.4 分析和討論51-52
• 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 第二篇 轉(zhuǎn)基因棉花治理土壤重金屬污染的研究56-104
• 摘要56-57
• ABSTRACT57-61
• 第一章 文獻(xiàn)綜述61-74
• 1.1 土壤重金屬污染情況以及危害61-62
• 1.2 重金屬污染土壤的治理方法62-64
• 1.3 轉(zhuǎn)基因植物修復(fù)被污染的土壤的研究進(jìn)展64-65
• 1.4 植物轉(zhuǎn)基因的方法65-67
• 1.4.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法65-66
• 1.4.2 基因槍法66
• 1.4.3 花粉管導(dǎo)入法66-67
• 1.4.4 其他方法67
• 1.5 棉花植物組織培養(yǎng)現(xiàn)狀67-72
• 1.5.1 體細(xì)胞胚胎發(fā)生67-71
• 1.5.1.1 影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生的因素67-69
• 1.5.1.2 胚性愈傷組織的形成和培養(yǎng)69
• 1.5.1.3 體細(xì)胞胚的萌發(fā)和成熟69-71
• 1.5.2 器官發(fā)生71-72
• 1.6 課題的研究目的和意義72-74
• 第二章 含ACBP1基因質(zhì)粒農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化74-84
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料74-78
• 2.1.1 菌種及質(zhì)粒74-75
• 2.1.2 儀器和設(shè)備75
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及溶液的配制75-77
• 2.1.3.1 實(shí)驗(yàn)試劑75-77
• 2.1.3.2 主要溶液的配制77
• 2.1.4 主要培養(yǎng)基成分和配制方法77-78
• 2.1.5 酶及引物78
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法78-81
• 2.2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌78-79
• 2.2.2 質(zhì)粒DNA的小量提取(質(zhì)粒小提取試劑盒法)79-80
• 2.2.3 瓊脂糖凝膠電泳80
• 2.2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA440480-81
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果81-82
• 2.3.1 質(zhì)粒的提取81
• 2.3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌與農(nóng)桿菌的卡那霉素抗性篩選81-82
• 2.3.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA440482
• 2.3.3.1 瓊脂糖凝膠電泳82
• 2.3.3.2 質(zhì)粒DNA測序鑒定82
• 2.4 分析與討論82-84
• 2.4.1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)82-84
• 第三章 農(nóng)桿菌介導(dǎo)ACBP1基因轉(zhuǎn)化棉花84-100
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料85-88
• 3.1.1 外植體材料85
• 3.1.2 儀器及設(shè)備85
• 3.1.3 主要溶液的配制85-88
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法88-92
• 3.2.1 無菌苗的獲得88
• 3.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)88-89
• 3.2.2.1 棉花品種的選擇88
• 3.2.2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類對棉花愈傷誘導(dǎo)的影響88-89
• 3.2.2.3 激素的選擇89
• 3.2.2.4 不同碳源對愈傷組織誘導(dǎo)的影響89
• 3.2.2.5 棉花愈傷組織的防褐化研究89
• 3.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化89-91
• 3.2.3.1 預(yù)培養(yǎng)對轉(zhuǎn)化的影響90
• 3.2.3.2 農(nóng)桿菌菌液濃度和浸染時間對出愈率的影響90
• 3.2.3.3 共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效率的影響90
• 3.2.3.4 愈傷組織的脫菌處理90-91
• 3.2.4 愈傷組織的生芽誘導(dǎo)91
• 3.2.4.1 培養(yǎng)基性質(zhì)(液體、固體)對誘導(dǎo)生芽的影響91
• 3.2.4.2 碳源對誘導(dǎo)生芽的影響91
• 3.2.4.3 赤霉素對生芽的影響91
• 3.2.4.4 AC、AgNO_3的添加對生芽的影響91
• 3.2.5 生根誘導(dǎo)91-92
• 3.2.5.1 培養(yǎng)基性質(zhì)對生根的影響91
• 3.2.5.2 不同碳源對生根的影響91
• 3.2.5.3 谷氨酰胺對生根的影響91-92
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果92-99
• 3.3.1 無菌苗的獲得92-93
• 3.3.2 愈傷組織的誘導(dǎo)93-96
• 3.3.2.1 棉花品種的選擇93-94
• 3.3.2.2 培養(yǎng)基的選擇94
• 3.3.2.3 激素水平對愈傷組織誘導(dǎo)的影響94-95
• 3.3.2.4 棉花愈傷組織的防褐化研究95-96
• 3.3.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化96-98
• 3.3.3.1 預(yù)培養(yǎng)對共轉(zhuǎn)化效率的影響96-97
• 3.3.3.2 菌液濃度和浸染時間對轉(zhuǎn)化情況的影響97
• 3.3.3.3 共培養(yǎng)時間對愈傷組織的影響97
• 3.3.3.4 愈傷組織的脫菌處理97-98
• 3.3.4 愈傷組織的生芽誘導(dǎo)98
• 3.3.4.1 培養(yǎng)基性質(zhì)對愈傷生芽的影響98
• 3.3.4.2 不同碳源對生芽的影響98
• 3.3.4.3 赤霉素對生芽的影響98
• 3.3.4.4 AC、AgNO_3的添加對生芽的影響98
• 3.3.5 生根誘導(dǎo)98-99
• 3.3.5.1 培養(yǎng)基性質(zhì)對生根的影響98
• 3.3.5.2 不同碳源對生根的影響98-99
• 3.3.5.3 谷氨酰胺對生根的影響99
• 3.4 分析與討論99-100
• 結(jié)論100-101
• 參考文獻(xiàn)101-104
• 致謝104-105
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄105-106

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1 高天虹;1、抗腫瘤藥物海鞘多肽CS5931的表達(dá)及分離純化研究 2、轉(zhuǎn)基因棉花治理土壤重金屬污染的研究[D];青島科技大學(xué);2015年

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本文編號：680165