本文關鍵詞：膽堿能抗炎通路功能的晝夜節(jié)律性研究

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【摘要】：炎癥是生命過程中常見而且重要的基本病理過程,凡是具有血管系統(tǒng)的活體組織在外部或內源性損傷因子的刺激下產(chǎn)生的防御性反應統(tǒng)稱為炎癥,在一定情況下,炎癥又可以誘導一些疾病,如腦部的炎癥容易壓迫中樞神經(jīng)、心肌炎在嚴重的情況下影響心臟的功能、過于劇烈的超敏反應甚至能威脅生命。臨床上多種慢性疾病的癥狀表現(xiàn)出晝夜節(jié)律,如心肌梗死(Myocardial infarction,MI)患者早晨的發(fā)病率更高;類風濕性關節(jié)炎患者(Rheumatoid arthritis,RA)表現(xiàn)為早晨關節(jié)僵硬。而時辰藥理學(Chronopharmacology)作為藥理學與時間生物學的交叉學科,雖然很早就被臨床醫(yī)生認識到有助于改善常規(guī)治療的療效并能降低副作用并發(fā)展成為時辰療法(Chronotherapy),但是目前為止被臨床認可的時辰療法并不多,主要原因是現(xiàn)有的時辰療法只能部分改善治療效果而不能實質性地治愈疾病,所以投入的研究資源很少。因此,對于炎癥性疾病的時辰療法還有很大的研究空間。膽堿能抗炎通路是指迷走神經(jīng)釋放的遞質乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)由細胞膜尼古丁α7受體(α7-nicotinic acetylcholine receptor,α7-n ACh R)介導,可以有效抑制巨噬細胞釋放炎癥因子,從而調節(jié)炎癥反應的程度,是一條神經(jīng)系統(tǒng)對全身炎癥調控的神經(jīng)-免疫調節(jié)通路。該通路最早在Nature由Borovikova發(fā)表,本實驗室在后期也利用該通路對動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)、心肌梗死(myocardial infarction,MI)等疾病的機制做了大量的研究工作,證明了該通路在相關疾病中起到的作用,并提出了很多新穎的觀點。本實驗室具備全自動時間節(jié)律動物飼養(yǎng)室,所以我們把膽堿能抗炎通路與晝夜節(jié)律的相關知識聯(lián)系了起來。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)關于膽堿能抗炎通路的抗炎功能是否有晝夜節(jié)律性的研究從未有過報道,那么該通路的抗炎功能是否有晝夜節(jié)律性呢?如果證明了這個假設是否可以為臨床治療提供新的思路呢?本課題以α7-n ACh R為中心,試圖驗證膽堿能抗炎通路是否有抗炎功能;證明其功能是否存在晝夜節(jié)律性;確定該通路與皮質醇(Cortisol)的抗炎節(jié)律的關系。根據(jù)這些假設,我們設計了相應的實驗。具體實驗結果如下:實驗一:膽堿能抗炎通路有明顯的抗炎作用利用特異性阻斷劑米非司酮(Mifepristone)和甲基牛扁堿(Methyllycaconitine,MLA)分別阻斷糖皮質激素受體(Glucocorticoid receptors,GR)和α7-n ACh R后用低濃度的內毒素(Lipopolysaccharide,LPS)造模,與對照組相比,兩個受體分別阻斷后,炎癥因子(IL-1β,TNFαand IL-6)的表達明顯升高,Mifepristone組的結果升高更明顯。實驗二:糖皮質激素(Glucocorticoids,GCs)和泡狀乙酰膽堿轉移體(Vesicular acetylcholine transporter,VACh T)的表達有晝夜節(jié)律性,膽堿能抗炎通路的抗炎節(jié)律可能和皮質醇的抗炎節(jié)律呈互補關系將正常小鼠分成8個組,每隔3h檢測其中一組血清內GCs的濃度,我們發(fā)現(xiàn)GCs的濃度晝夜間是有差異的,0點最高,值為382.9 ng/ml(n=7,p0.05),15點最低,值為69.5 ng/ml(n=7,p0.05)。肝臟和腎臟內VACh T的WB結果顯示其表達節(jié)律與皮質醇相反,在活躍期表達相對較少,在靜止期表達量相對較多。實驗三:炎癥因子的表達呈晝夜節(jié)律變化將正常小鼠分成8個組,每隔3h用低濃度LPS造模,我們發(fā)現(xiàn),三種炎癥因子(IL-1β,TNFαand IL-6)的表達節(jié)律組間有相似的變化,且節(jié)律與GCs的分泌節(jié)律呈明顯的反比關系,在靜止期高,最高點在15點,活躍期低,最低點在6點。實驗四:毒膿血癥模型小鼠的生存率存在晝夜節(jié)律變化將正常小鼠分成8個組,每隔3h用高濃度的LPS造模,觀察72h。我們發(fā)現(xiàn)活躍期(21點、0點、3點、6點、)造模的小鼠平均生存率明顯高于靜止期(9點、12點、15點、18點)造模的小鼠。其中15:00與3:00比較(χ2=7.428,P=0.006),有顯著性差異。實驗五:膽堿能抗炎通路抗炎作用不能夠改變炎癥因子的表達節(jié)律將正常小鼠隨即分成8組,在3點對其中4組小鼠分別腹腔注射丙二醇、Mifepristone(40mg/kg)、MLA(10mg/kg)以及兩藥合用后,用低濃度LPS造模,15點以同樣的方法對另外4組造模。我們發(fā)現(xiàn)在炎癥狀態(tài)下,各組炎癥因子的表達趨勢在靜止期都高于活躍期;MLA組與對照組相比,IL-6的表達在活躍期和靜止期都升高,有顯著性差異(P0.05);Mifepriston組與對照組相比,各炎癥因子的表達在兩個階段都顯著升高,TNF-α和IL-6靜止期相對于活躍期的表達差異消失,IL-1β在兩個階段的結果有顯著性差異(P0.05);MLA+Mifepriston組與對照組相比,各炎癥因子的表達進一步提高,TNF-α、IL-6的結果顯示兩個階段的晝夜差異消失,IL-1β的結果顯示靜止期高于活躍期的節(jié)律,結果有顯著性差異(P0.05)。實驗六:膽堿能抗炎通路的功能不足以改變毒膿血癥模型小鼠的生存率的晝夜差異對照組為機體抗炎功能正常的情況下,毒膿血癥模型小鼠的生存率活躍期高于靜止期(χ2=4.041,P=0.044);MLA組與對照組相比,小鼠在兩個時間段的生存率都降低,活躍期仍高于靜止期(χ2=5.520,P=0.019);Mifepristone組和MLA+Mifepriston小鼠與對照組相比,在兩個階段的生存率與對照組相比均急劇下降,但相同給藥組活躍期和靜止期之間沒有顯著性差異。結論:1、皮質醇和膽堿能抗炎通路在體內的抗炎機制中都起著很重要的作用。2、膽堿能抗炎通路的抗炎功能弱于皮質醇,在皮質醇的抗炎功能被抑制后,膽堿能抗炎功能不能夠改變本實驗模型小鼠機體整體的抗炎節(jié)律,不能改變機體炎癥反應的結局,沒有明顯的晝夜節(jié)律性。3、機體在皮質醇和膽堿能抗炎通路外還存在其他的抗炎機制,其整體的晝夜節(jié)律性與皮質醇的抗炎節(jié)律相同。
【關鍵詞】：膽堿能抗炎通路 晝夜節(jié)律 炎癥 時辰藥理學 皮質醇 內毒素血癥
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-12
• 縮略詞表12-13
• 前言13-17
• 第一部分 GCs和膽堿能抗炎通路的抗炎作用17-25
• 材料與方法17-23
• 實驗結果23-24
• 實驗小結24-25
• 第二部分 機體炎癥反應規(guī)律、ACh以及GCs表達的晝夜節(jié)律性25-40
• 材料與方法25-34
• 實驗結果34-39
• 實驗小結39-40
• 第三部分 膽堿能抗炎功能是否存在晝夜節(jié)律性,與GCs的關系40-45
• 材料與方法40-42
• 實驗結果42-44
• 實驗小結44-45
• 討論45-48
• 結論48-49
• 參考文獻49-54
• 綜述54-62
• 參考文獻59-62
• 在讀期間發(fā)表論文情況62
• 參加科研工作情況62-63
• 致謝63-64

【共引文獻】

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本文編號：678817