發(fā)布時間：2017-08-14 02:36

  本文關(guān)鍵詞：化療藥物伊立替康對腹腔巨噬細胞的毒性和機制研究

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【摘要】：目的:伊立替康(Irinotecan,CPT-11)是喜樹堿的半合成衍生物,是治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的一線化療藥物。其活性代謝產(chǎn)物SN-38通過抑制拓撲異構(gòu)酶I從而起到抗腫瘤作用。研究表明它應(yīng)用于臨床治療癌癥,提高化療有效率的同時還可誘發(fā)嚴重的惡心、嘔吐、遲發(fā)性腹瀉甚至潰瘍等腸炎癥狀。并且,CPT-11引發(fā)腹瀉、腸炎等毒副作用的機制尚不明確,尤其對腹腔巨噬細胞的毒副作用研究還很少。本課題通過腹腔注射CPT-11,檢測CPT-11對小鼠腹腔巨噬細胞組成及表型影響,并探討其誘導(dǎo)腹腔常駐型巨噬細胞凋亡的機制。鑒于腹腔常駐型巨噬細胞與B-1細胞及腸道穩(wěn)態(tài)的關(guān)系,本論文還研究CPT-11對B-1細胞的影響,從而初步探討CPT-11引發(fā)腹瀉、腸炎等毒副作用的機制。方法:1.體外實驗:采用改進的MTT法(WST-1)檢測CPT-11對小鼠巨噬細胞系RAW 264.7細胞增殖的影響;利用Hoechst 33342染色觀察細胞核形態(tài);并用碘化丙啶(PI)染色結(jié)合流式細胞術(shù)分析CPT-11對RAW 264.7細胞周期及細胞凋亡的影響;免疫印跡法檢測CPT-11對RAW 264.7細胞中cleaved caspase-3、PARP(聚腺苷二磷酸核糖聚合酶)及細胞周期相關(guān)蛋白的影響。2.動物實驗:通過腹腔注射CPT-11,每天監(jiān)測小鼠體重,96 h后處死小鼠,蘇木精-伊紅染色(HE染色)分析小鼠結(jié)腸和空腸炎癥狀態(tài);利用流式細胞術(shù)分析小鼠腹腔巨噬細胞表面分子CD11b、F4/80和MHC II,B細胞表面分子CD19和CD23的表達;并用PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)分析小鼠腹腔巨噬細胞周期及細胞凋亡的影響;利用免疫熒光顯微技術(shù)分析小鼠腹腔巨噬細胞中轉(zhuǎn)錄因子gata6及凋亡執(zhí)行蛋白酶cleavedcaspase-3表達的變化;免疫印跡法檢測小鼠腹腔巨噬細胞中cleavedcaspase-3及其底物parp蛋白的變化。結(jié)果:1.cpt-11處理呈時間和劑量依賴關(guān)系抑制raw264.7細胞的增殖,24h和48h的ic50分別為81.36μmol/l和18.84μmol/l,表明cpt-11對raw264.7細胞有一定毒性。通過cpt-11的處理,raw264.7細胞的體積變大,細胞核增大,部分細胞的細胞核發(fā)生碎裂(顯示細胞已凋亡),并且使原本貼壁生長、具有偽足的細胞變圓而脫落。cpt-11可誘導(dǎo)raw264.7細胞產(chǎn)生亞二倍體峰(顯示dna降解和細胞凋亡),且細胞凋亡率呈濃度依賴性上升。同時,處于g2/m期細胞呈濃度依賴性增多。cpt-11可誘導(dǎo)raw264.7細胞中caspase-3的活化,使其底物parp水平下降,同時上調(diào)細胞周期蛋白cyclinb1,下調(diào)cyclind1的表達。2.cpt-11能明顯誘導(dǎo)小鼠體重下降并誘發(fā)腸炎。he染色結(jié)果顯示,經(jīng)cpt-11處理的小鼠,其結(jié)腸和空腸產(chǎn)生炎癥病灶,淋巴細胞侵潤炎癥部位。3.cpt-11下調(diào)腹腔中大亞群巨噬細胞的數(shù)量,抑制腹腔巨噬細胞中g(shù)ata6的表達。cpt-11呈劑量依賴性誘導(dǎo)處于g2/m、sub-g0/g1期的腹腔巨噬細胞數(shù)量明顯增加,顯示cpt-11可誘導(dǎo)細胞周期阻滯。cpt-11能使腹腔巨噬細胞中cleavedcaspase-3的含量明顯增加,而parp的表達量明顯降低,顯示細胞正處于凋亡過程中。caspase-3的抑制劑z-devd-fmk能明顯拮抗cpt-11抑制gata6表達和下調(diào)parp表達量的作用。4.cpt-11處理在影響巨噬細胞的同時,還明顯下調(diào)腹腔中b細胞、b-1細胞數(shù)量。結(jié)論:1.cpt-11通過誘導(dǎo)細胞周期阻滯而抑制raw264.7細胞增殖,通過激活caspase-3通路誘導(dǎo)細胞凋亡。2.cpt-11通過誘導(dǎo)腹腔常駐巨噬細胞細胞周期阻滯和依賴caspase-3通路的細胞凋亡來下調(diào)腹腔常駐巨噬細胞數(shù)量。3.cpt-11抑制腹腔巨噬細胞gata6的表達,可能導(dǎo)致其影響腹腔常駐巨噬細胞功能及腹腔b-1細胞的數(shù)量及功能。由于腹腔常駐巨噬細胞和b細胞數(shù)量和功能受到抑制,腸道固有免疫功能下降,可能是CPT-11誘導(dǎo)腹瀉和腸炎的主要原因。
【關(guān)鍵詞】：伊立替康 腹腔常駐巨噬細胞 細胞凋亡 GATA6 B-1細胞
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• 英文摘要6-11
• 1 前言11-21
• 1.1 伊立替康（CPT-11）的作用靶點- DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅰ11-12
• 1.2 伊立替康（CPT-11）的代謝過程12-13
• 1.3 伊立替康（CPT-11）的抗腫瘤活性13-14
• 1.4 伊立替康（CPT-11）治療過程中產(chǎn)生的毒副作用14-15
• 1.5 針對伊立替康（CPT-11）應(yīng)用過程中缺陷的優(yōu)化措施15-16
• 1.6 腹腔巨噬細胞的概述16-17
• 1.7 巨噬細胞與腸道穩(wěn)態(tài)的關(guān)系17-19
• 1.8 本課題的研究目的及意義19-21
• 2 實驗材料和方法21-29
• 2.1 實驗材料21-25
• 2.2 實驗方法25-29
• 3 實驗結(jié)果29-40
• 3.1 CPT-11對RAW 264.7 細胞增殖和細胞形態(tài)的影響29-30
• 3.2 CPT-11誘導(dǎo)RAW 264.7 細胞凋亡呈劑量依賴性30
• 3.3 CPT-11對RAW 264.7 細胞周期的影響30-31
• 3.4 CPT-11對RAW 264.7 細胞中caspase-3 活化及細胞周期相關(guān)蛋白表達的影響31-32
• 3.5 CPT-11能夠減少小鼠體重并誘發(fā)腸炎32-33
• 3.6 CPT-11下調(diào)腹腔中大亞群巨噬細胞的數(shù)量33-35
• 3.7 CPT-11對腹腔巨噬細胞中GATA6表達的影響35
• 3.8 CPT-11誘導(dǎo)腹腔巨噬細胞周期阻滯及凋亡35-36
• 3.9 CPT-11激活caspase-3 途徑誘導(dǎo)腹腔巨噬細胞細胞凋亡36-37
• 3.10 z-DEVD-fmk抑制CPT-11激活的caspase-3 途徑37-38
• 3.11 CPT-11下調(diào)腹腔中B-1 細胞數(shù)量38-40
• 4 討論40-43
• 5 全文總結(jié)43-44
• 參考文獻44-52
• 附錄 英文縮略詞52-54
• 在學(xué)期間發(fā)表論文清單54-55
• 致謝55-56

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本文編號：670352