本文關鍵詞：表達HSA-IFNα2b的CHO細胞穩(wěn)定株的構建及其無血清培養(yǎng)基優(yōu)化

  更多相關文章： 人血清白蛋白 干擾素α2b 中國倉鼠卵巢細胞 無血清培養(yǎng)基 丁酸鈉

【摘要】：干擾素α2b(Interferonα2b,IFNα2b)是一種用于病毒性疾病和腫瘤性疾病治療的多功能細胞因子,因其在體內的半衰期短從而限制其在臨床上的應用。本研究室已成功構建人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)融合蛋白長效藥物開發(fā)平臺,將HSA與IFNα2b的N端(HSA-IFNα2b)融合并在畢赤酵母中成功表達。HSA-IFNα2b具有較好活性,但在畢赤酵母中表達融合蛋白時,存在融合蛋白不穩(wěn)定、容易降解、產物不均一等問題。目前,中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary,CHO)表達系統(tǒng)表達的蛋白免疫原性低、人體相容性好、活性高。本課題將已經在畢赤酵母中表達HSA-IFNα2b的重組蛋白在高級表達系統(tǒng)CHO中進行表達制備,優(yōu)化CHO發(fā)酵培養(yǎng)基并放大培養(yǎng)。本研究將IFNα2b連接到HSA的C端,構建融合蛋白HSA-IFNα2b。構建真核表達質粒pMH3/HSA-IFNa2b,電轉轉入CHO細胞中。經G418的抗性壓力篩選和目的蛋白的表達量篩選,最終獲得一株高表達的穩(wěn)定細胞株(CHO/pMH3/HSA-IFNa2b)。表達的目的蛋白經Western Blot驗證顯示,產物具有IFNα2b和HSA的雙抗原性。經懸浮馴化穩(wěn)定后,通過批次篩選得到一株穩(wěn)定的高克隆表達株,產量約為31 mg/L。重組細胞株的穩(wěn)定性試驗結果顯示,不同代數(shù)之間蛋白的表達量和生長情況沒有明顯的差異。最終,獲得一株能懸浮培養(yǎng)、穩(wěn)定表達的單克隆細胞株。為篩選獲得最優(yōu)的懸浮培養(yǎng)基,本研究選擇十七種商業(yè)化無血清培養(yǎng)基,快速篩選得到生長和表達良好的基礎培養(yǎng)基(BM)和流加培養(yǎng)基(F4)。進一步優(yōu)化培養(yǎng)基,通過在培養(yǎng)基中添加功能性添加因子丁酸鈉、亞油酸、乙醇胺、蘇拉明。結果顯示,在培養(yǎng)基中添加丁酸鈉作為培養(yǎng)基的添加因子,獲得高表達的個性化無血清培養(yǎng)基。重組細胞株在BM中培養(yǎng),當細胞密度超過8×106 cells/m L,繼續(xù)補加F4可以支持細胞批次培養(yǎng)超過10×106 cells/mL,同時在500 m L搖瓶中培養(yǎng)時間至10 d,融合蛋白表達量達到61.5 mg/L。通過添加的2 mM丁酸鈉,融合蛋白表達增長至81 mg/L。進一步考察添加丁酸鈉的過程中細胞的生長代謝情況,結果顯示:丁酸鈉添加后24 h細胞處于G1期比例由41%升高到62.9%,同時提高融合蛋白HSA-IFNα2b mRNA的表達高達2.6倍,并對細胞生長代謝無明顯影響。最后,在3 L搖瓶中進行了流加培養(yǎng),并在5 L的AP-20一次性生物反應器上進行通氣與攪拌方面工藝的初步摸索,在反應器上得到與搖瓶中相對一致的培養(yǎng)效果,融合蛋白表達量達到137 mg/L,實現(xiàn)了從搖瓶到反應器的工藝放大。離心獲得發(fā)酵上清液后,依次通過藍色親和染料層析、疏水層析對表達產物進行分離純化,獲得的融合蛋白HSA-IFNα2b純度96.8%,目的蛋白的總回收率為22.3%。對純化后融合蛋白的活性進行檢測,比活性為4.16×106 IU/mg,與畢赤酵母表達融合蛋白HSA-IFNα2b的生物活性水平基本相當。
【關鍵詞】：人血清白蛋白 干擾素α2b 中國倉鼠卵巢細胞 無血清培養(yǎng)基 丁酸鈉
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 第一章 緒論9-19
• 1.1 長效干擾素的研究9-11
• 1.1.1 干擾素簡介9
• 1.1.2 長效干擾素的研究9-11
• 1.2 中國倉鼠卵巢細胞表達系統(tǒng)的概述11-13
• 1.2.1 不同表達系統(tǒng)的研究11-12
• 1.2.2 中國倉鼠卵巢細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)點12
• 1.2.3 高效穩(wěn)定的CHO表達系統(tǒng)策略的建立12-13
• 1.3 無血清培養(yǎng)基的研究13-16
• 1.3.1 無血清培養(yǎng)基的發(fā)展過程13
• 1.3.2 無血清培養(yǎng)基中的添加因子13-14
• 1.3.3 無血清培養(yǎng)基的優(yōu)化以及個性化14-15
• 1.3.4 無血清培養(yǎng)基的懸浮適應15-16
• 1.4 細胞培養(yǎng)工藝的研究16-17
• 1.4.1 細胞培養(yǎng)的模式16-17
• 1.4.2 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)過程參數(shù)17
• 1.5 立題意義和研究內容17-19
• 第二章 實驗材料和方法19-29
• 2.1 實驗材料19-21
• 2.1.1 菌株、細胞株、質粒及引物19
• 2.1.2 實驗試劑19-20
• 2.1.3 儀器設備20-21
• 2.1.4 培養(yǎng)基及溶液配制21
• 2.2 實驗方法21-29
• 2.2.1 CHO細胞的培養(yǎng)與保種21-22
• 2.2.2 CHO重組細胞的構建22-23
• 2.2.3 重組細胞的構建與篩選23-24
• 2.2.4 細胞的懸浮馴化24
• 2.2.5 細胞批次培養(yǎng)實驗24-25
• 2.2.6 細胞穩(wěn)定性驗證25
• 2.2.7 蛋白檢測方法25-26
• 2.2.8 基礎培養(yǎng)基批次篩選26
• 2.2.9 流加培養(yǎng)基篩選實驗26
• 2.2.10 特殊因子的添加以及丁酸鈉的流加培養(yǎng)26
• 2.2.11 細胞周期測定26
• 2.2.12 RNA提取和熒光定量PCR26-27
• 2.2.13 細胞培養(yǎng)過程中生化指標測定27
• 2.2.14 搖瓶的 3 L流加培養(yǎng)27
• 2.2.15 使用AP-20 一次性生物反應器 5 L流加培養(yǎng)27
• 2.2.16 融合蛋白的純化27-28
• 2.2.17 純化樣品純度檢測28
• 2.2.18 純化樣品的生物活性檢測28-29
• 第三章 結果與討論29-46
• 3.1 融合蛋白表達質粒構建29
• 3.2 重組CHO細胞的構建與篩選29-32
• 3.2.1 CHO細胞株的構建及高克隆篩選29-31
• 3.2.2 重組CHO細胞懸浮馴化和批次實驗31
• 3.2.3 重組細胞穩(wěn)定性實驗31-32
• 3.3 無血清培養(yǎng)基的篩選優(yōu)化32-39
• 3.3.1 基礎培養(yǎng)基的初篩和混合測試32-34
• 3.3.2 流加培養(yǎng)基篩選34-35
• 3.3.3 特殊因子的添加對細胞影響35-36
• 3.3.4 丁酸鈉的添加對細胞影響36-39
• 3.4 搖瓶的 3 L流加培養(yǎng)和 5 L一次性生物反應器的流加培養(yǎng)39-41
• 3.4.1 搖瓶的 3 L流加培養(yǎng)39-40
• 3.4.2 AP-20 一次性 5 L激流生物反應器流加培養(yǎng)40-41
• 3.5 HSA-IFNα2b的分離純化41-43
• 3.5.1 Blue Sepharose FF親和層析41-42
• 3.5.2 Phenyl Sepharose FF疏水層析42-43
• 3.6 HSA-IFNα2b的檢測43-46
• 3.6.1 純化樣品純度檢測43-44
• 3.6.2 純化后樣品Western Blot驗證44
• 3.6.3 純化樣品生物活性檢測44-45
• 3.6.4 純化樣品分子量檢測45-46
• 第四章 主要結論與展望46-47
• 4.1 主要結論46
• 4.2 下一步研究工作展望46-47
• 致謝47-48
• 參考文獻48-52
• 附錄: 作者在攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文52

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