本文關(guān)鍵詞：從天然藥物中提取醛糖還原酶抑制劑及其活性研究

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【摘要】：隨著生活水平的提高、人口老齡化生活方式的改變,糖尿病發(fā)病率逐年增加。全世界有糖尿病患者3.82億,我國(guó)的糖尿病患者已達(dá)1.14億。糖尿病造成的死亡,已居當(dāng)今世界死亡原因的第5位。目前全球每年約有320萬(wàn)人死于糖尿病誘發(fā)的并發(fā)癥,在大部分發(fā)展中國(guó)家,已經(jīng)成為多數(shù)國(guó)家人口死亡的主要死因之一。糖尿病及糖尿病并發(fā)癥（diabetic complications, DCC）的治療一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。隨著糖尿病患者病情的發(fā)展，患者易患糖尿病慢性并發(fā)癥，約73.2%的糖尿病患者伴有一種或多種糖尿病并發(fā)癥，而且晚期糖尿病并發(fā)癥病人生存率非常低。研究發(fā)現(xiàn)多元醇代謝通路（polyol pathway，PP）的激活與糖尿病慢性并發(fā)癥有關(guān)，醛糖還原酶（aldose reductase，AR）是體內(nèi)糖代謝多元醇通路的關(guān)鍵酶，目前臨床上醛糖還原酶抑制劑是預(yù)防、延緩和治療糖尿病并發(fā)癥的首選藥物之一。但由于此類藥物副作用大，限制了其臨床使用，迫切需要開(kāi)發(fā)新的更安全有效醛糖還原酶抑制劑。同時(shí)又由于醛糖還原酶價(jià)格昂貴，不利于建立一種高通量篩選醛糖還原酶抑制劑的模型。天然藥物是指植物，動(dòng)物，礦物等自然界中存在的有藥理活性的天然產(chǎn)物。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥市場(chǎng)對(duì)天然藥物需求的日益增大，呈現(xiàn)出快速增長(zhǎng)的勢(shì)頭，對(duì)其進(jìn)行研究已經(jīng)成為當(dāng)今非常熱門(mén)的課題。天然藥物的應(yīng)用在中國(guó)有悠久的歷史，與傳統(tǒng)化學(xué)合成藥物相比，天然藥物更易獲得，毒副作用小，成本更低，越來(lái)越受到人們的青睞，成為人們防病治病的優(yōu)先選擇。 本課題從天然藥物中篩選醛糖還原酶抑制劑，并對(duì)其活性進(jìn)行初步研究。通過(guò)檢測(cè)醛糖還原酶關(guān)鍵輔酶NADPH的吸光度變化來(lái)衡量醛糖還原酶抑制程度，篩選出的對(duì)醛糖還原酶抑制效果突出的藥物通過(guò)晶狀體模型和腎小球系膜細(xì)胞模型再次篩選，晶狀體和腎小球是糖尿病并發(fā)癥影響較典型的部位，通過(guò)這兩個(gè)部位的生理生化指標(biāo)能夠更好的反映天然藥物對(duì)醛糖還原酶的抑制活性。本實(shí)驗(yàn)初步建立用于篩選具有抑制醛糖還原酶活性的天然化合物的藥物模型，以多個(gè)角度從天然藥物中篩選抑制糖尿病并發(fā)癥的藥物，為糖尿病及其并發(fā)癥尋找新的治療藥物，特別是為體外篩選新的具有天然藥物活性的醛糖還原酶抑制劑提供方法和依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)分為四部分： 1.從新鮮牛眼晶狀體中提取醛糖還原酶，在磷酸鹽緩沖液中手動(dòng)研磨，梯度鹽析，離心，透析，得到粗酶，，通過(guò)測(cè)定酶的活力和蛋白濃度測(cè)得酶的比活力為2.93U/mg，適合進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。 2.選取80種天然藥物，水提有效成分，從中篩選針對(duì)醛糖還原酶的抑制劑，根據(jù)IC50值篩選得到紅景天，鴉膽子，青果，鹿衍草，僵蠶，麥冬等效果較好的藥物，通過(guò)高糖晶狀體模型和高糖腎小球系膜細(xì)胞（HBZY-1)模型，測(cè)得可溶性蛋白和各種抗氧化指標(biāo)，綜合地評(píng)價(jià)藥物對(duì)醛糖還原酶導(dǎo)致的糖尿病并發(fā)癥的治療作用。 3.與藥物共同培養(yǎng)的高糖晶狀體通過(guò)石蠟切片直觀地觀察藥物對(duì)于機(jī)體的積極作用。上述藥物對(duì)于高糖損傷后的晶狀體均有一定程度的恢復(fù)作用。 4.高糖和氧化損傷會(huì)導(dǎo)致晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）的產(chǎn)生，AGEs會(huì)直接導(dǎo)致糖尿病的各種并發(fā)癥，實(shí)驗(yàn)最后對(duì)抑制醛糖還原酶IC50值較低的藥物紅景天，鴉膽子，青果，鹿衍草進(jìn)行討論，上述藥物均對(duì)晚期糖基化終產(chǎn)物的抑制效果較好，與醛糖還原酶抑制劑的結(jié)果相符。
【關(guān)鍵詞】：2型糖尿病 醛糖還原酶 天然藥物 篩選 抑制劑
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R914;R96
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第一章 前言10-21
• 1.1 2 型糖尿病10-18
• 1.1.1 2 型糖尿病及其并發(fā)癥簡(jiǎn)介10-12
• 1.1.2 抗糖尿病藥物的主要分類和作用靶點(diǎn)12-16
• 1.1.3 醛糖還原酶與糖尿病并發(fā)癥的關(guān)系16-18
• 1.2 醛糖還原酶抑制劑治療 2 型糖尿病18-20
• 1.2.1 醛糖還原酶抑制劑研究現(xiàn)狀18-19
• 1.2.2 天然藥物篩選醛糖還原酶抑制劑研究現(xiàn)狀19-20
• 1.3 研究目的及意義20-21
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法21-31
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21-23
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料21
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器21-22
• 2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)溶液配制22-23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-31
• 2.2.1 天然藥物的提取方法23
• 2.2.2 牛眼晶狀體中醛糖還原酶的提取方法23-24
• 2.2.3 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定醛糖還原酶蛋白質(zhì)濃度24
• 2.2.4 醛糖還原酶活性測(cè)定24-25
• 2.2.5 醛糖還原酶抑制劑的抑制活性篩選與測(cè)定25-26
• 2.2.6 高糖誘導(dǎo)晶狀體26
• 2.2.7 高糖培養(yǎng)后的晶狀體石蠟切片，HE 染色26
• 2.2.8 測(cè)定高糖培養(yǎng)后的晶狀體內(nèi)可溶性蛋白含量26-27
• 2.2.9 測(cè)定高糖培養(yǎng)后的晶狀體內(nèi) SOD 含量27-28
• 2.2.10 高糖培養(yǎng) HBZY-1 細(xì)胞，MTT 毒性測(cè)定28-29
• 2.2.11 測(cè)定腎小球系膜細(xì)胞（HBZY-1）谷胱甘肽量29
• 2.2.12 測(cè)定腎小球系膜細(xì)胞 SOD 量29-30
• 2.2.13 體外測(cè)定晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）30-31
• 第三章 結(jié)果與討論31-41
• 3.1 牛眼晶狀體提取醛糖還原酶31-41
• 3.1.1 牛眼晶狀體中提取醛糖還原酶的蛋白濃度測(cè)定31-32
• 3.1.2 牛眼晶狀體中提取醛糖還原酶酶活力32
• 3.1.3 酶的比活力32-33
• 3.1.4 天然藥物的醛糖還原酶抑制活力33-34
• 3.1.5 高糖培養(yǎng)后的晶狀體石蠟切片，HE 染色34-35
• 3.1.6 天然藥物培養(yǎng)后的晶狀體可溶性蛋白濃度變化測(cè)定35-36
• 3.1.7 高糖培養(yǎng)后的晶狀體內(nèi) SOD 含量36-37
• 3.1.8 天然藥物水提取物細(xì)胞毒性測(cè)定37-38
• 3.1.9 測(cè)定給藥后 HBZY-1 細(xì)胞谷胱甘肽量(mg/L）38-39
• 3.1.10 測(cè)定給藥后 HBZY-1 細(xì)胞 SOD 量(U/mL）39
• 3.1.11 體外測(cè)定晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）含量：39-41
• 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-47
• 讀研期間發(fā)表的文章47-48
• 致謝48

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