發(fā)布時(shí)間：2017-08-01 05:31

  本文關(guān)鍵詞：球形芽胞桿菌X050晶體蛋白的特性及其抗腫瘤活性研究

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【摘要】：從長(zhǎng)沙岳麓山采集的土樣中篩選出一株芽胞桿菌,經(jīng)抗腫瘤活性檢測(cè),結(jié)合形態(tài)特征觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及16S rRNA基因Blast同源序列比對(duì)分析,確定了一株含伴胞晶體且高毒力球形芽胞桿菌新菌株,命名為L(zhǎng)ysinibacillus sphaericus X050,簡(jiǎn)稱BsX050(保藏號(hào)CCTCC NO:M 2014160)。測(cè)定BsX050菌株的發(fā)酵生長(zhǎng)曲線,收集不同生長(zhǎng)階段的上清液,進(jìn)行抗腫瘤實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)BsX050菌株進(jìn)入穩(wěn)定期后,發(fā)酵上清液對(duì)B16細(xì)胞和HeLa細(xì)胞具有明顯的毒性。用60%的硫酸銨沉淀,粗提蛋白進(jìn)行抗腫瘤譜的測(cè)定,結(jié)果表明BsX050菌株發(fā)酵上清液對(duì)B16、4T1、Hep-3B、HT29、MCF-7和HeLa具有廣譜的抗腫瘤活性。進(jìn)一步用GE-蛋白純化儀(AKTA)和安捷倫超高效液相色譜(UHPLC)對(duì)發(fā)酵液中抗腫瘤活性物的分離純化條件進(jìn)行了初步優(yōu)化。提取BsX050菌株的伴胞晶體進(jìn)行電鏡觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)伴胞晶體呈圓形或橢圓形,結(jié)構(gòu)松散,致密性不好;SDS-PAGE檢測(cè)及膠內(nèi)酶解質(zhì)譜鑒定,其為Surface protein SlpC OS,分子量為125kDa。Zn2+對(duì)伴孢晶體產(chǎn)量影響的分析表明Zn2+的濃度為10-6mol/L時(shí)伴胞晶體產(chǎn)量提高,Zn2+的濃度為10-3mol/L時(shí)伴胞晶體的產(chǎn)生基本被抑制。對(duì)伴胞晶體進(jìn)行溶解性和穩(wěn)定性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該伴胞晶體在pH為12.5,且不含β-巰基乙醇的50mM Na2CO3溶液中溶解出較多的晶體蛋白,胰蛋白酶與晶體蛋白的體積比為1/10,在37℃放置3h后,晶體蛋白全部被酶解成晶體毒素蛋白。晶體毒素蛋白作用4T1細(xì)胞,Hep-3B細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞24h后,倒置顯微鏡和掃描電鏡下觀察到4T1和Hep-3B形態(tài)發(fā)生明顯變化,而HUVEC的形態(tài)無(wú)明顯變化,采用MTT法測(cè)定晶體毒素蛋白對(duì)4T1、Hep-3B和HUVEC的細(xì)胞毒力,發(fā)現(xiàn)晶體毒素蛋白對(duì)4T1和Hep-3B細(xì)胞毒力呈時(shí)間與濃度的依賴性,而對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響。激光共聚焦顯微鏡觀察到晶體毒素蛋白能損傷4T1和Hep-3B的亞顯微結(jié)構(gòu),細(xì)胞核皺縮變小,微管蛋白減少并向細(xì)胞核靠攏使細(xì)胞變圓,線粒體熒光強(qiáng)度減弱,而對(duì)HUVEC的亞顯微結(jié)構(gòu)無(wú)明顯的損傷,晶體毒素蛋白處理4T1和Hep-3B細(xì)胞后,提取其DNA,凝膠電泳檢測(cè)到DNA“梯狀”條帶,流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)晶體毒素蛋白誘導(dǎo)4T1細(xì)胞發(fā)生凋亡,使細(xì)胞被阻滯在G0/G1期,western blotting發(fā)現(xiàn)Bax蛋白及PARP剪切蛋白表達(dá)上調(diào),Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)。上述結(jié)果表明,晶體毒素蛋白對(duì)4T1和Hep-3B細(xì)胞毒性強(qiáng),使其亞顯微結(jié)構(gòu)受損;晶體毒素蛋白誘導(dǎo)4T1細(xì)胞凋亡,使其被阻滯在G0/G1期,而對(duì)HUVEC細(xì)胞毒性不明顯。這為球形芽胞桿菌毒蛋白的應(yīng)用及其抗腫瘤機(jī)理的研究提供了菌株資源和奠定了理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：球形芽胞桿菌 發(fā)酵上清 晶體蛋白 抗腫瘤活性 凋亡
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R915
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 第一章 引言13-24
• 1.1 芽胞桿菌簡(jiǎn)介13-14
• 1.2 球形芽胞桿菌的研究14-16
• 1.2.1 球形芽胞桿菌的基本特征14-15
• 1.2.2 球形芽胞桿菌的應(yīng)用15-16
• 1.2.2.1 球形芽胞桿菌在蚊蟲(chóng)防治中的作用15-16
• 1.2.2.2 球形芽胞桿菌在環(huán)境中的作用16
• 1.2.2.3 球形芽胞桿菌在抗腫瘤中的作用16
• 1.3 抗腫瘤藥物的研究進(jìn)展16-23
• 1.3.1 惡性腫瘤概述16-17
• 1.3.2 抗腫瘤藥物研究現(xiàn)狀17-18
• 1.3.3 抗腫瘤藥物獲取途徑18-20
• 1.3.4 芽胞桿菌抗腫瘤研究20-23
• 1.3.4.1 芽胞桿菌代謝產(chǎn)物抗腫瘤研究20-21
• 1.3.4.2 芽胞桿菌parasporins抗腫瘤研究21-23
• 1.4 立題依據(jù)和意義23-24
• 第二章 材料與方法24-41
• 2.1 材料24-31
• 2.1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞24
• 2.1.2 引物24-25
• 2.1.3 培養(yǎng)基和抗生素25
• 2.1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)基和抗生素25
• 2.1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)基和抗生素25
• 2.1.4 試劑25-29
• 2.1.4.1 主要試劑25-26
• 2.1.4.2 試劑盒26
• 2.1.4.3 酶和Marker26
• 2.1.4.4 瓊脂糖凝膠電泳緩沖液試劑26
• 2.1.4.5 SDS-PAGE電泳試劑26-28
• 2.1.4.6 膠內(nèi)酶解試劑28-29
• 2.1.5 反應(yīng)體系29-30
• 2.1.5.1 PCR體系29
• 2.1.5.2 酶切體系29
• 2.1.5.3 連接體系29-30
• 2.1.6 主要儀器設(shè)備30-31
• 2.2 方法31-41
• 2.2.1 BsX050的分離純化與鑒定31-33
• 2.2.1.1 BsX050分離純化31-32
• 2.2.1.2 BsX050形態(tài)觀察32
• 2.2.1.3 BsX05016S rRNA基因同源序列分析32-33
• 2.2.2 BsX050生長(zhǎng)曲線測(cè)定33
• 2.2.3 BsX050生理生化實(shí)驗(yàn)33
• 2.2.4 BsX050發(fā)酵液抗腫瘤活性測(cè)定33-35
• 2.2.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)33-34
• 2.2.4.2 BsX050不同生長(zhǎng)階段發(fā)酵上清液細(xì)胞毒性檢測(cè)34
• 2.2.4.3 BsX050的代謝產(chǎn)物粗提物的抗腫瘤譜測(cè)定34-35
• 2.2.4.4 BsX050發(fā)酵上清中抗腫瘤活性物的分離35
• 2.2.5 BsX050伴胞晶體的特性35-37
• 2.2.5.1 BsX050伴胞晶體的提取35-36
• 2.2.5.2 電鏡觀察BsX050伴胞晶體36
• 2.2.5.3 SDS-PAGE分析BsX050晶體蛋白36
• 2.2.5.4 BsX050晶體蛋白的膠內(nèi)酶解質(zhì)譜鑒定36
• 2.2.5.5 BsX050晶體蛋白的溶解性和穩(wěn)定性分析36-37
• 2.2.5.6 Zn~(2+)對(duì)晶體蛋白相對(duì)含量的影響37
• 2.2.5.7 測(cè)定BsX050菌株在含Zn~(2+)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線37
• 2.2.8 BsX050晶體毒素蛋白的抗腫瘤活性檢測(cè)37-41
• 2.2.8.1 MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞存活率38
• 2.2.8.2 掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化38
• 2.2.8.3 免疫熒光觀察細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的變化38-39
• 2.2.8.4 DNA Ladder檢測(cè)細(xì)胞凋亡39
• 2.2.8.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡與壞死39
• 2.2.8.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期阻滯39-40
• 2.2.8.7 Western blotting檢測(cè)凋亡蛋白40-41
• 第三章 結(jié)果和分析41-63
• 3.1 BSX050鑒定41-45
• 3.1.1.形態(tài)特征41
• 3.1.2.系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建41-43
• 3.1.3.生理生化特征43-44
• 3.1.4 BsX050生長(zhǎng)曲線44-45
• 3.2 BSX050發(fā)酵液抗腫瘤活性45-46
• 3.2.1 不同時(shí)期抗腫瘤活性45
• 3.2.2 BsX050代謝產(chǎn)物粗提物的抗腫瘤譜測(cè)定45-46
• 3.3.代謝活性物的初步分離純化46-49
• 3.4.BSX050伴胞晶體特性研究49-54
• 3.4.1 BsX050伴胞晶體形態(tài)特性49
• 3.4.2 BsX050晶體蛋白SDS-PAGE檢測(cè)及膠內(nèi)酶解質(zhì)譜鑒定49-50
• 3.4.3 BsX050晶體蛋白的溶解性和穩(wěn)定性分析50-53
• 3.4.4 Zn~(2+)對(duì)BsX050菌株晶體蛋白產(chǎn)量的影響53
• 3.4.5 Zn~(2+)對(duì)BsX050菌株生長(zhǎng)的影響53-54
• 3.5.BSX050晶體毒素蛋白抗腫瘤活性研究54-63
• 3.5.1 BsX050晶體毒素蛋白對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響54-56
• 3.5.2 BsX050晶體毒素蛋白對(duì)細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖的影響56-57
• 3.5.3 BsX050晶體毒素蛋白對(duì)細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的影響57-59
• 3.5.4 DNA Ladder59
• 3.5.5 BsX050晶體毒素蛋白誘導(dǎo) 4T1細(xì)胞發(fā)生凋亡59-60
• 3.5.6 western blotting檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白60-61
• 3.5.7 BsX050晶體毒素蛋白使 4T1細(xì)胞阻滯在G0/G1期61-63
• 第四章 討論63-69
• 4.1 BSX050發(fā)酵液抗腫瘤活性63-64
• 4.2 芽胞桿菌代謝物分離及鑒定64-65
• 4.3 BSX050晶體蛋白65
• 4.4 BSX050晶體毒素蛋白抗腫瘤活性65-66
• 4.5 BSX050晶體蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡66-67
• 4.6 BSX050晶體蛋白對(duì)細(xì)胞周期的影響67-69
• 第五章 小結(jié)69-70
• 參考文獻(xiàn)70-78
• 縮略詞表78-79
• 論文發(fā)表情況79-80
• 本論文感謝以下項(xiàng)目的資助80-81
• 致謝81

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本文編號(hào)：602752