本文關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌Sortase A小分子抑制劑的研究

  更多相關(guān)文章： 金黃色葡萄球菌 SrtA轉(zhuǎn)肽酶 致病性 共價(jià)抑制劑

【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)能夠引起局部組織化膿感染、肺炎、敗血癥等疾病,嚴(yán)重威脅著人類的身體健康。近年來,由于抗生素的大量使用甚至濫用,使得醫(yī)院和社區(qū)中出現(xiàn)了大量的耐藥病原菌,如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin Resistant S.aureus,MRSA)和耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(Vancomycin Resistant S.aureus,VRSA)。目前,細(xì)菌的耐藥性已經(jīng)成為日益嚴(yán)峻的全球性公共衛(wèi)生問題,對(duì)于抗菌感染新類型藥物的研發(fā)已經(jīng)刻不容緩�？股刂饕ㄟ^殺菌或抑制細(xì)菌生長(zhǎng)來達(dá)到治療細(xì)菌感染的效果,但同時(shí)也會(huì)影響宿主體內(nèi)的益生菌的生存狀態(tài),破壞體內(nèi)的微生態(tài)平衡,從而產(chǎn)生對(duì)宿主有害的副作用。近年來,抗毒力治療(Anti-virulence therapies)作為新型抗細(xì)菌感染的策略,可以通過干預(yù)細(xì)菌的致病能力而非直接殺死細(xì)菌來達(dá)到治療效果,是目前抗細(xì)菌感染藥物研究的前沿?zé)狳c(diǎn)。在革蘭氏陽性菌內(nèi),轉(zhuǎn)肽酶Sortase A(SrtA)主要負(fù)責(zé)將20多種表面毒力因子蛋白錨定到細(xì)菌的細(xì)胞壁上。據(jù)報(bào)道srtA基因與革蘭氏陽性菌的致病力密切相關(guān),但其并不是細(xì)菌生存與生長(zhǎng)所必需的。因此抑制SrtA的活性不會(huì)對(duì)病原菌帶來生存壓力,并且在臨床上也可能會(huì)降低針對(duì)抑制SrtA轉(zhuǎn)肽活性的耐藥性菌株出現(xiàn)的機(jī)率。綜上所述,S.aureus SrtA(SaSrtA)是抗細(xì)菌毒力因子潛在的藥物作用候選靶標(biāo)。合作實(shí)驗(yàn)室以Pyranonaphthoquinone類天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)中參與生物還原烷基化過程的苯醌并吡喃內(nèi)酯類三環(huán)為關(guān)鍵母核骨架,對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,合成了大約200個(gè)化合物。本論文利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)構(gòu)建SaSrtA小分子抑制劑的篩選體系,針對(duì)這200個(gè)化合物篩選能夠干預(yù)SaSrtA轉(zhuǎn)肽反應(yīng)活性的小分子抑制劑,最終我們得到了16個(gè)具有較好抑制活性的化合物,IC_(50)在2-80μM之間�；诨衔锏睦砘再|(zhì)和抑制活性考慮,對(duì)化合物SOMCL-14-283及其相差異構(gòu)體SOMCL-14-284開展進(jìn)一步的體外研究:(1)SDS-PAGE的轉(zhuǎn)肽實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩個(gè)化合物均抑制SaSrtA對(duì)底物蛋白質(zhì)(Sa IsdA)的轉(zhuǎn)肽活性,并且化合物SOMCL-14-283的抑制活性比SOMCL-14-284的活性提高3倍左右,這與通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移測(cè)得的IC_(50)具有一致性;(2)質(zhì)譜結(jié)果顯示,化合物SOMCL-14-283不可逆共價(jià)修飾SaSrtA的Cys184位點(diǎn)。(3)圓二色譜(CD)揭示SOMCL-14-283在最高濃度為400μM時(shí)對(duì)SaSrtA蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)沒有顯著的影響。隨后,細(xì)菌細(xì)胞上,利用FITC-IGg和western blot的技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞壁SpA的含量,發(fā)現(xiàn)可以顯著降低金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁SpA的錨定量。在150μM濃度下,兩個(gè)化合物對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)幾乎沒有影響以及MIC值也均大于200μM。此外,我們發(fā)現(xiàn)SOMCL-14-283還具有抑制廣譜革蘭氏陽性菌SrtA的活性。本論文以發(fā)現(xiàn)新靶標(biāo)和新機(jī)制的新型抗菌感染活性化合物為目標(biāo),針對(duì)與致病力密切相關(guān)的SrtA進(jìn)行高通量篩選評(píng)價(jià)以及結(jié)構(gòu)改造的合作研究,發(fā)現(xiàn)了具有明確抑制SrtA活性的化合物SOMCL-14-283,并進(jìn)一步研究了其抑制SaSrtA活性的分子機(jī)制。因此,本研究為開發(fā)與傳統(tǒng)抗生素作用機(jī)制不同的新型抗菌藥物提供了有意義的嘗試以及為SrtA共價(jià)抑制劑的設(shè)計(jì)與篩選提供了新的方向。
【關(guān)鍵詞】：金黃色葡萄球菌 SrtA轉(zhuǎn)肽酶 致病性 共價(jià)抑制劑
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 前言13-31
• 1.1 金黃色葡萄球菌感染現(xiàn)狀13-16
• 1.1.1 病原菌耐藥形勢(shì)迫切需要抗菌新藥研發(fā)13-14
• 1.1.2 抗生素研發(fā)歷史進(jìn)程和未來趨勢(shì)14-15
• 1.1.3 基于抗-致病力（Anti-virulence）策略的抗菌藥物研發(fā)成為熱點(diǎn)15-16
• 1.2 SaSrtA是一個(gè)理想的抗致病力的靶標(biāo)16-18
• 1.3 SaSrtA的結(jié)構(gòu)18-20
• 1.4 SaSrtA的抑制劑研究進(jìn)展20-31
• 1.4.1 Diarylacrylonitriles21-22
• 1.4.2 Aryl( β-amino )ethyl Ketones22-23
• 1.4.3 Rhodanines、Pyridazinones和Pyrazolethiones23-25
• 1.4.4 Morpholinobenzoate衍生物25-26
• 1.4.5 Dihydro-β-carboline26-27
• 1.4.6 Benzo[d]isothiazol-3(2H)-one-adamantane衍生物27-28
• 1.4.7 綠原酸（CHA）和櫟素（QEN）28-29
• 1.4.8 3,6-Disubstituted Triazolothiazoles29-31
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法31-49
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料31-35
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒和菌株31
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物31
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)所用試劑31-32
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)所用儀器32-34
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)所用試劑的配制34-35
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法35-49
• 2.2.1 轉(zhuǎn)肽酶SaSrtA蛋白的表達(dá)35
• 2.2.2 轉(zhuǎn)肽酶SaSrtA蛋白的純化35-36
• 2.2.3 轉(zhuǎn)肽酶SaSrtA的轉(zhuǎn)肽活性測(cè)定36-37
• 2.2.4 SaSrtA酶活水平的抑制劑篩選37
• 2.2.5 活性化合物的IC_(50)測(cè)定37-38
• 2.2.6 化合物的可逆性抑制的研究38
• 2.2.7 動(dòng)力學(xué)測(cè)試實(shí)驗(yàn)38-39
• 2.2.8 SDS-PAGE轉(zhuǎn)肽活性實(shí)驗(yàn)39-40
• 2.2.9 轉(zhuǎn)肽酶SaSrtA的晶體培養(yǎng)、結(jié)構(gòu)解析及其與化合物SOMCL14283共結(jié)晶40
• 2.2.10 圓二色譜（CD）40-41
• 2.2.11 基于FITC-IGg檢測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞壁上的SPA含量的影響41
• 2.2.12 熒光標(biāo)記的熱遷移實(shí)驗(yàn)（Fluorescence-Based Thermal Shift Assay）41-42
• 2.2.13 Western Blotting 檢測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞壁上的 SPA 含量的影響42-43
• 2.2.14 高分辨蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量分析43-44
• 2.2.15 FASP酶解肽斷質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)44-45
• 2.2.16 化合物對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響45-46
• 2.2.17 化合物的動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)46
• 2.2.18 金黃色葡萄球菌感染動(dòng)物（小鼠）實(shí)驗(yàn)46-49
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論49-71
• 3.1 SaSrtA蛋白的純化49-50
• 3.2 測(cè)定SaSrtA的米氏方程及Km值50
• 3.3 小分子抑制劑IC_(50)的測(cè)定50-53
• 3.4 基于SDS-PAGE對(duì)化合物抑制SaSrtA進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證53-55
• 3.5 小分子抑制劑與SaSrtA的作用模式55-56
• 3.6 利用質(zhì)譜檢測(cè)化合物與SaSrtA的作用方式為不可逆的共價(jià)結(jié)合56-58
• 3.6.1 化合物完全抑制SaSrtA的活性所需要的比例56-57
• 3.6.2 質(zhì)譜分析57-58
• 3.7 FASP酶解肽斷二級(jí)質(zhì)譜確定化合物與SaSrtA的184位半胱氨酸不可逆共價(jià)結(jié)合58-59
• 3.8 化合物與SaSrtA共價(jià)結(jié)合的動(dòng)力學(xué)曲線59-60
• 3.9 圓二色譜（CD）60-61
• 3.10 運(yùn)用FITC-IGg的方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁上的SPA含量驗(yàn)證化合物在活體水平上的抑制活性61-63
• 3.11 通過western blot的方法進(jìn)一步驗(yàn)證化合物在活體水平上的抑制活性63-65
• 3.12 化合物對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響65-67
• 3.12.1 化合物對(duì)Sa. Newman、Sa. 8325-4、Se. 1457、Bs. 681、Ec. DH5α的最小抑制細(xì)菌濃度（MIC）65-66
• 3.12.2 化合物SOMCL14283、SOMCL14284對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線66-67
• 3.13 化合物的動(dòng)物毒性實(shí)驗(yàn)67-68
• 3.14 小鼠感染模型68
• 3.15 檢測(cè)化合物SOMCL14283與化合物SOMCL14284對(duì)其它革蘭氏陽性菌株的轉(zhuǎn)肽酶Sa SrtA的抑制作用68-71
• 第四章 實(shí)驗(yàn)總結(jié)與討論71-75
• 4.1 實(shí)驗(yàn)總結(jié)71-72
• 4.2 討論72-75
• 參考文獻(xiàn)75-85
• 附錄85-87
• 簡(jiǎn)歷及攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果87

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 白潔;機(jī)組配餐員的金黃色葡萄球菌污染情況[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊(cè));2002年02期

2 朱自強(qiáng);;金黃色葡萄球菌更具殺傷力的原因在于其金黃色“外殼”[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2005年11期

3 杜洪利;張雙雙;歐旭;閆訓(xùn)友;;金黃色葡萄球菌檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J];食品與發(fā)酵科技;2009年05期

4 黃嶺芳;賴衛(wèi)華;張莉莉;;食品中金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J];食品與機(jī)械;2009年06期

5 王娉;勞華均;胡s，

本文編號(hào)：593524