本文關(guān)鍵詞：非諾貝特改善糖尿病小鼠血管內(nèi)皮功能及其機(jī)制研究

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【摘要】：研究目的：糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是影響人類健康的全球性公共問題,預(yù)計(jì)到2030年全球糖尿病患者將增至4.39億。糖尿病微血管并發(fā)癥(Microvascular complications)和大血管并發(fā)癥(Macrovascular complications)是糖尿病患者傷殘和死亡的重要原因。高血糖導(dǎo)致的內(nèi)皮功能障礙(Endothelial dysfunction)使血管舒張功能和收縮功能受損,破壞了血管的完整性。內(nèi)皮功能障礙被認(rèn)為是1型和2型糖尿病的早期標(biāo)志,可用于血管疾病的獨(dú)立預(yù)測。因此,改善血管內(nèi)皮功能對于糖尿病并發(fā)癥的預(yù)防和治療具有重要意義。非諾貝特(Fenofibrate, FF)是過氧化物酶體增殖物激活受體α(Peroxisome proliferator-activated receptor α, PPARα)的激動(dòng)劑,臨床用于降血脂。2010年美國心臟病學(xué)學(xué)會(huì)公布的ACCORD (Action to Control Cardiovascular Risk in Diabetes)試驗(yàn)表明,非諾貝特聯(lián)合辛伐他汀的治療能降低伴血脂異常的2型糖尿病患者的心血管并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)。一氧化氮(Nitric oxide, NO)由內(nèi)皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase, eNOS)產(chǎn)生,參與調(diào)節(jié)血管功能,在炎癥和血管病變發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。NO的生物利用度取決于其產(chǎn)生和降解失活之間的平衡。糖尿病高血糖導(dǎo)致的高氧化應(yīng)激(Oxidative stress,OS)狀態(tài)使eNOS脫耦聯(lián),超氧化陰離子(Superoxide onion, O2-)過度產(chǎn)生,導(dǎo)致NO生物利用度降低。另一方面,NO的生物利用度降低,使血小板聚集增強(qiáng)、血管內(nèi)皮細(xì)胞對單核細(xì)胞粘附作用增加而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。腺苷單磷酸鹽激活蛋白激酶(Adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)是高靈敏度的細(xì)胞代謝傳感器,可控制下游目標(biāo)蛋白eNOS的表達(dá)。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí),激活A(yù)MPK可通過增加p-eNOS的表達(dá)改善血管功能障礙。本課題研究：非諾貝特是否能夠改善糖尿病小鼠內(nèi)皮依賴性舒張功能；非諾貝特是否能夠改善高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙；通過測定AMPK和eNOS磷酸化水平探索非諾貝特改善內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的可能機(jī)制。研究方法：1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)雄性C57小鼠,4周齡,隨機(jī)分為三組：對照組(Control)、糖尿病模型組(Streptozotocin, STZ)、非諾貝特治療組(STZ+FF),模型組和非諾貝特治療組小鼠連續(xù)5天腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ) 60mg/kg誘導(dǎo)糖尿病模型。非諾貝特治療組小鼠以100mg/kg/d的非諾貝特劑量連續(xù)灌胃2周。各組小鼠采用甘油三脂(Triglyceride, TG)試劑盒和高密度脂蛋白膽固醇(High-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)試劑盒測定TG和HDL-C的含量。治療結(jié)束后處死動(dòng)物,分離各組小鼠主動(dòng)脈,利用Organ bath血管張力系統(tǒng)檢測各組小鼠離體主動(dòng)脈對乙酰膽堿(Acetylcholine, ACh)的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能(Endothelium-dependent relaxation, EDR)、對硝普鈉(Sodium nitroprusside, SNP)的非內(nèi)皮依賴性血管舒張功能(Endothelium-independent relaxation),對去氧腎上腺素(Phenhylephrine,Phe)的血管收縮功能(Contractile responses);利用二氫乙錠(Dihydroethidium,DHE)染色檢測小鼠主動(dòng)脈超氧陰離子(Superoxide onion, O2-)水平；利用Western blotting檢測各組小鼠主動(dòng)脈中eNOS和p-eNOS的表達(dá)水平。2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)利用免疫熒光技術(shù)鑒定小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Mouse aortic endothelial cells, MAECs),將鑒定后的細(xì)胞分為三組：對照組(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖模型組(33mmol/L葡萄糖)、非諾貝特處理組(5 μM非諾貝特+33mmol/L葡萄糖)。將各組細(xì)胞置于95%02和5%CO2、37℃孵箱孵育24 h后,用vitronectin測定細(xì)胞粘附能力,用matrigel膠測定細(xì)胞小管生成能力,用DAF-FM(3-Amino,4-aminomethyl-2', 7-difluorescein, diacetate)染色檢測細(xì)胞中NO水平,用DHE染色檢測細(xì)胞O2-水平,利用Western blotting檢測細(xì)胞中eNOS、p-eNOS以及AMPK、p-AMPK的表達(dá)水平。研究結(jié)果：1.非諾貝特能夠改善STZ糖尿病小鼠血管內(nèi)皮功能障礙1)非諾貝特降低糖尿病小鼠血清TG含量與對照組相比,糖尿病模型組小鼠血清TG含量明顯升高；與模型組比較,非諾貝特治療后糖尿病小鼠血清TG含量明顯降低。2)非諾貝特升高糖尿病小鼠血清HDL-C含量與對照組相比,糖尿病模型組小鼠血清HDL-C含量無明顯變化；與模型組比較,非諾貝特治療后糖尿病小鼠血清HDL-C含量明顯升高。3)非諾貝特改善糖尿病小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能與對照組相比,糖尿病小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮對ACh依賴的舒張功能顯著降低；非諾貝特治療后能夠顯著改善糖尿病小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能障礙。非諾貝特對糖尿病小鼠主動(dòng)脈收縮功能無明顯影響；L-NAME消除非諾貝特對小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能的改善作用；非諾貝特對糖尿病小鼠主動(dòng)脈非內(nèi)皮依賴性舒張功能無明顯影響。這些結(jié)果提示：非諾貝特能夠改善糖尿病小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能。4)非諾貝特降低糖尿病小鼠主動(dòng)脈O2-水平與對照組相比,糖尿病模型組小鼠主動(dòng)脈中O2-水平明顯上升,而非諾貝特治療組小鼠主動(dòng)脈O2-水平顯著降低。5)非諾貝特對糖尿病小鼠主動(dòng)脈eNOS表達(dá)無明顯影響6)蛋白檢測結(jié)果表明：;NOS和p-eNOS在對照組、糖尿病模型組,以及非諾貝特治療組的糖尿病小鼠主動(dòng)脈中的表達(dá)并無顯著差異。2.非諾貝特能夠改善高糖誘導(dǎo)的MAECs功能障礙1)MAECs的鑒定用免疫熒光方法鑒定MAECs,血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF) /Hoechst 33258雙染陽性的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的82%。2)非諾貝特減輕高糖誘導(dǎo)的MAECs粘附功能損傷與對照組相比,高糖處理組的MAECs粘附能力明顯降低；非諾貝特處理后MAECs粘附能力顯著提高。3)非諾貝特改善高糖誘導(dǎo)的MAECs小管形成功能障礙與對照組相比,高糖處理組的MAECs小管形成能力明顯降低；非諾貝特處理后MAECs小管形成能力顯著提高。4)非諾貝特阻止高糖誘導(dǎo)的MAECs內(nèi)NO表達(dá)下降與對照組相比,高糖處理組的MAECs內(nèi)NO水平明顯降低；非諾貝特處理后細(xì)胞內(nèi)NO水平顯著提高。5)非諾貝特抑制高糖誘導(dǎo)的MAECs內(nèi)O2-表達(dá)與對照組相比,高糖處理組的MAECs內(nèi)O2-水平明顯上升；非諾貝特處理后細(xì)胞內(nèi)O2-水平顯著降低。6)非諾貝特促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的MAECs內(nèi)eNOS和AMPK磷酸化激活與對照組相比,高糖處理組的MAECs內(nèi)p-eNOS和p-AMPK表達(dá)明顯降低；非諾貝特處理后細(xì)胞內(nèi)p-eNOS和p-AMPK表達(dá)顯著增加。結(jié)論：非諾貝特能夠改善糖尿病小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能,改善高糖誘導(dǎo)的MAECs功能障礙,機(jī)制涉及AMPK/eNOS通路。
【關(guān)鍵詞】：非諾貝特 糖尿病 血管內(nèi)皮功能 小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R965
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-13
• 縮略詞表13-14
• 前言14-17
• 材料和方法17-35
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-52
• 討論52-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-62
• 綜述62-69
• 參考文獻(xiàn)65-69
• 碩士在讀期間發(fā)表文章69-70
• 致謝70-71

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 王銘;雷燕;陳連鳳;苗立夫;;人參三七川芎提取物抑制p53基因表達(dá)促進(jìn)衰老內(nèi)皮細(xì)胞增殖的研究[J];中華中醫(yī)藥雜志;2015年02期

2 肖丹;蔡雙兵;趙坤;司良毅;;老年冠心病患者血漿腺苷酸活化蛋白激酶α1的初步臨床研究[J];中華老年心腦血管病雜志;2015年06期

3 程亮;徐永;;老年2型糖尿病患者靜息心率與腎臟損害的相關(guān)性研究[J];實(shí)用老年醫(yī)學(xué);2015年05期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 劉洋;心律失常的臨床和遺傳學(xué)基礎(chǔ)及治療相關(guān)的并發(fā)癥[D];華中科技大學(xué);2013年

2 孫瑜隆;神經(jīng)肽FF和新型手性螺環(huán)氧化吲哚類化合物的抗炎活性及作用機(jī)制研究[D];蘭州大學(xué);2013年

3 劉洋;心律失常的臨床和遺傳學(xué)基礎(chǔ)及治療相關(guān)的并發(fā)癥[D];華中科技大學(xué);2013年

4 邢莎莎;紅景天苷改善血管內(nèi)皮功能及其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用與分子機(jī)制[D];華中科技大學(xué);2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王君;人Scn5a基因及PRKAG2基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞模型建立[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2014年

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本文編號：590469