本文關(guān)鍵詞：莪術(shù)醇抗乳腺癌轉(zhuǎn)移作用及潛在靶標(biāo)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

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【摘要】：背景:乳腺癌是當(dāng)今世界女性最多發(fā)的惡性腫瘤之一。2016年《Cancer Statistics》數(shù)據(jù)顯示,2015年美國(guó)女性癌癥發(fā)病率中乳腺癌以29%的比率獨(dú)占鰲頭,死亡率僅次于肺癌,居第二位。在中國(guó),2009-2011年間女性癌癥發(fā)病率顯著增加。其中,乳腺癌位居第一位,且呈逐年增加態(tài)勢(shì)。中藥莪術(shù)在傳統(tǒng)上用于治療宮頸癌、乳腺癌等婦科腫瘤,莪術(shù)油被認(rèn)為是主要的活性物質(zhì)基礎(chǔ),其中莪術(shù)醇是代表性化合物之一。目前,莪術(shù)醇抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的報(bào)道還很少,其潛在分子機(jī)制還需要深入研究。本課題獲得了中央高�；A(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目基金(XDJK2014B044)的支持。目的:進(jìn)一步明確莪術(shù)醇在抑制乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲與粘附方面的作用,深入地闡明其可能的新型分子機(jī)制和分析潛在的靶標(biāo)蛋白。方法:利用磺酰羅丹明B(SRB)法檢測(cè)細(xì)胞存活率,平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。采用Ibidi劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)乳腺癌細(xì)胞體外的遷移能力。通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)明確莪術(shù)醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。利用Matrigel粘附實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)乳腺癌細(xì)胞粘附基底膜的能力。免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá),明膠酶譜法檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。采用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)莪術(shù)醇對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響。采用二維凝膠電泳技術(shù)分離莪術(shù)醇與溶劑對(duì)照處理后的MDA-MB-231細(xì)胞蛋白,分析差異表達(dá)蛋白,切取差異表達(dá)的蛋白點(diǎn),并通過(guò)MALDI-TOF/TOF進(jìn)行鑒定。利用Gene Ontology(GO)分析法明確差異蛋白的功能類(lèi)別,利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析所涉及的相關(guān)通路,分析出可能與莪術(shù)醇抗乳腺癌轉(zhuǎn)移作用相關(guān)的靶標(biāo),再利用Protein-Protein Interaction prediction(PPI)法找出與潛在靶標(biāo)相互作用的蛋白質(zhì)。最后,采用RT-PCR方確認(rèn)在m RNA水平莪術(shù)醇對(duì)潛在蛋白靶標(biāo)表達(dá)的影響。結(jié)果:1.莪術(shù)醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲和粘附的影響SRB法檢測(cè)莪術(shù)醇細(xì)胞毒性顯示,當(dāng)莪術(shù)醇濃度小于40μg/ml作用24 h后對(duì)MDA-MB-231和4T1細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性。連續(xù)處理14天后,40μg/ml莪術(shù)醇可顯著抑制克隆的形成。為排除細(xì)胞毒性的影響,本研究選用10、20、40μg/ml濃度的莪術(shù)醇進(jìn)一步明確其體外抗乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲和粘附能力。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和Ibdi劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,莪術(shù)醇處理MDA-MB-231細(xì)胞8 h后,其體外遷移能力顯著降低。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,莪術(shù)醇能夠顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力。粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,莪術(shù)醇能明顯降低MDA-MB-231細(xì)胞粘附能力。2.莪術(shù)醇抗乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移可能與JNK/Akt/NF-κB介導(dǎo)的MMP-9信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)明膠酶譜結(jié)果顯示,莪術(shù)醇作用MDA-MB-231細(xì)胞24 h后,MMP-9酶活性降低。Western Blot分析顯示,莪術(shù)醇處理MDA-MB-231細(xì)胞后,MMP-9蛋白表達(dá)降低,JNK1/2、Akt磷酸化水平降低。同時(shí),莪術(shù)醇亦抑制了NF-κB p65蛋白的核轉(zhuǎn)移與轉(zhuǎn)錄活性。并且,JNK1/2抑制劑SP600125和PI3K-Akt抑制劑LY294002能夠分別增強(qiáng)莪術(shù)醇對(duì)NF-κB p65蛋白核轉(zhuǎn)移的抑制作用。同時(shí),JNK1/2抑制劑SP600125、PI3K-Akt抑制劑LY294002和NF-κB抑制劑PDTC均能分別顯著增強(qiáng)莪術(shù)醇對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)的抑制作用以及莪術(shù)醇對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲和粘附的抑制作用。3.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定莪術(shù)醇抗乳腺癌轉(zhuǎn)移作用的潛在靶標(biāo)采用二維凝膠電泳技術(shù)分離莪術(shù)醇與溶劑對(duì)照作用的MDA-MB-231細(xì)胞蛋白,共發(fā)現(xiàn)了19個(gè)差異蛋白,采用MALDI-TOF/TOF生物質(zhì)譜成功鑒定了其中11個(gè)蛋白。GO分析顯示,此11種蛋白分布在不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中,參與了多種重要的生物過(guò)程,表現(xiàn)出不同的分子功能。KEGG分析可知,鑒定的11種蛋白參與到76條信號(hào)通路中。特別地,結(jié)合GO分析結(jié)果,KEGG分析結(jié)果和查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)其中4個(gè)蛋白(EEF1A1、NRAS、SUB1、ACAT2)可能與莪術(shù)醇抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲和粘附有關(guān)。我們利用PPI分析得到與這4種蛋白相互作用的蛋白。最后,應(yīng)用RT-PCR對(duì)這4個(gè)靶標(biāo)在m RNA水平進(jìn)行驗(yàn)證,證實(shí)了莪術(shù)醇能夠在轉(zhuǎn)錄水平上劑量依賴(lài)性地調(diào)控這4個(gè)蛋白的m RNA水平,與基于二維凝膠技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)論相符合。結(jié)論:莪術(shù)醇具有抑制乳腺癌細(xì)胞體外遷移、侵襲和粘附的作用,其調(diào)控機(jī)制一方面可能與JNK/Akt/NF-κB介導(dǎo)的MMP9信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。另一方面蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)EEF1A1、NRAS、SUB1、ACAT2可能是莪術(shù)醇抗乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的潛在靶標(biāo)。
【關(guān)鍵詞】：莪術(shù)醇 基質(zhì)金屬蛋白酶-9 遷移 侵襲 蛋白質(zhì)組學(xué)
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R96
【目錄】：

• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 文獻(xiàn)綜述13-19
• 第一章 選題依據(jù)19-23
• 1.1．引言19
• 1.2．腫瘤的轉(zhuǎn)移與MMPs19-20
• 1.2.1．腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移19
• 1.2.2．腫瘤的轉(zhuǎn)移與MMPs19-20
• 1.3．莪術(shù)醇在乳腺癌治療方面的研究進(jìn)展與目前研究存在的問(wèn)題20
• 1.4．本課題的出發(fā)點(diǎn)及研究意義20
• 1.5．課題研究的研究?jī)?nèi)容及預(yù)期結(jié)果20-23
• 第二章 莪術(shù)醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲和粘附的影響23-33
• 2.1．儀器與材料23
• 2.1.1．儀器設(shè)備23
• 2.1.2．實(shí)驗(yàn)材料23
• 2.2．實(shí)驗(yàn)方法23-25
• 2.2.1．主要溶液的配置23-24
• 2.2.2．細(xì)胞株的培養(yǎng)24
• 2.2.3．細(xì)胞存活率的測(cè)定24
• 2.2.4．平板克隆實(shí)驗(yàn)24
• 2.2.5．劃痕實(shí)驗(yàn)24-25
• 2.2.6．Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)25
• 2.2.7．粘附實(shí)驗(yàn)25
• 2.2.8．統(tǒng)計(jì)分析25
• 2.3．結(jié)果25-29
• 2.3.1．莪術(shù)醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和 4T1的細(xì)胞毒性25-26
• 2.3.2．莪術(shù)醇抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲26-29
• 2.3.3. 莪術(shù)醇抑制乳腺癌細(xì)胞的粘附作用29
• 2.4．討論29-31
• 2.5．小結(jié)31-33
• 第三章 莪術(shù)醇抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的基質(zhì)金屬蛋白酶機(jī)制研究33-49
• 3.1．儀器與材料33-34
• 3.1.1．儀器設(shè)備33
• 3.1.2．實(shí)驗(yàn)材料33-34
• 3.2．實(shí)驗(yàn)方法34-38
• 3.2.1．主要溶液的配置34-35
• 3.2.2. 細(xì)胞株的培養(yǎng)35
• 3.2.3．劃痕實(shí)驗(yàn)35
• 3.2.4．Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)35
• 3.2.5．粘附實(shí)驗(yàn)35-36
• 3.2.6．雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)36
• 3.2.7．總蛋白提取36
• 3.2.8．核蛋白的提取36
• 3.2.9．Bradford法測(cè)定蛋白濃度36-37
• 3.2.10．Western Blot檢測(cè)分析37-38
• 3.2.11．MMP-9 酶譜活性分析38
• 3.2.12．統(tǒng)計(jì)分析38
• 3.3．實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-46
• 3.3.1．莪術(shù)醇對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞MMP-9 的抑制以及磷酸化的JNK1/2，，磷酸化的Akt和NF-κB的抑制38-42
• 3.3.2．莪術(shù)醇對(duì)MMP-9 蛋白的抑制可能與JNK1/2、Akt、NF-κB通路相關(guān)2442-43
• 3.3.3．莪術(shù)醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲和粘附的抑制可能與JNK1/2、Akt和NF-κB相關(guān)43-46
• 3.4．討論46-48
• 3.5．小結(jié)48-49
• 第四章 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析莪術(shù)醇抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在作用靶標(biāo)49-63
• 4.1．主要材料儀器49-50
• 4.1.1．主要材料逑逑49
• 4.1.2．儀器設(shè)備49-50
• 4.2．實(shí)驗(yàn)方法50-54
• 4.2.1．配液50-51
• 4.2.2．細(xì)胞株的培養(yǎng)51
• 4.2.3．藥物處理與蛋白的提取51
• 4.2.4．第一向等電聚焦51
• 4.2.5．第二向SDS-PAGE分離51-52
• 4.2.6．銀染52
• 4.2.7．考馬斯亮藍(lán)染色52
• 4.2.8．圖像的掃描分析與凝膠的保存52
• 4.2.9．質(zhì)譜前處理52
• 4.2.10．MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析鑒定52-53
• 4.2.11．總RNA提取53
• 4.2.12．RT-PCR檢測(cè)53
• 4.2.13．統(tǒng)計(jì)分析53-54
• 4.3．實(shí)驗(yàn)結(jié)果54-59
• 4.3.1．蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定莪術(shù)醇作用的差異表達(dá)蛋白54
• 4.3.2．GO分析法分析鑒定的蛋白54-55
• 4.3.3．KEGG法分析鑒定的蛋白55-58
• 4.3.4．莪術(shù)醇抑制腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證58-59
• 4.4．討論59-61
• 4.5．小結(jié)61-63
• 全文總結(jié)63-65
• 本課題的創(chuàng)新點(diǎn)65-67
• 思考與展望67-69
• 參考文獻(xiàn)69-75
• 中英文縮略名詞對(duì)照表75-79
• 致謝79-81
• 碩士學(xué)位期間科研工作匯報(bào)81-82
• 文章發(fā)表81
• 獲得獎(jiǎng)勵(lì)81-82
• 參加會(huì)議82

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