本文關(guān)鍵詞：大腸桿菌K12外排泵及調(diào)控基因缺失菌株的構(gòu)建及其功能的研究

  更多相關(guān)文章： 大腸桿菌 基因敲除 AcrAB-TolC AcrEF 靶位突變

【摘要】：細菌對抗生素耐藥性的產(chǎn)生伴隨著抗生素長期大量的使用,細菌耐藥性的產(chǎn)生方式有多種,其中對于革蘭氏陰性桿菌中的大腸桿菌而言,外排泵Acr AB-Tol C是引起其對多種抗生素耐藥的一個最重要的系統(tǒng),本文旨在研究外排泵基因或者部分調(diào)控基因缺失后菌株在環(huán)丙沙星選擇壓力下耐藥性的產(chǎn)生機制。本研究首先利用Red同源重組建立了大腸桿菌K12染色體基因敲除技術(shù),將以兩端攜帶FRT序列的質(zhì)粒p KD3和p KD4為模板擴增出的PCR產(chǎn)物成功替代了大腸桿菌K12中的acr A、acr B、tol C、mar A、mar R、sox S和sox R,獲得了外排泵基因及調(diào)控基因敲除菌,測定原菌K12以及7株敲除菌的生長曲線,利用半固體瓊脂方法測定了8株菌的移動能力,發(fā)現(xiàn)各敲除菌的生長速率以及移動能力沒有顯著改變。在環(huán)丙沙星濃度遞增的條件下誘導(dǎo)K12及其敲除菌株,分別獲得系耐藥菌株,采用二倍稀釋法測定各菌株的MIC,利用PCR的方法檢測了gyr A、gyr B、par C和par E基因QRDR區(qū)的突變以及負向調(diào)控因子acr R、mar R、sox R突變情況。利用RT-PCR方法檢測了誘導(dǎo)突變株中外排泵基因、調(diào)控基因和膜孔蛋白基因的表達水平。結(jié)果表明,當(dāng)敲除Acr AB-Tol C中的tol C基因時,在濃度遞增的環(huán)丙沙星選擇壓力下很難篩選出耐藥菌株,說明Acr AB-Tol C的完整性對菌株耐藥性發(fā)展有重要作用。誘導(dǎo)耐藥株靶位基因突變類型具有多樣性,與耐藥有關(guān)的突變位點有Gyr A的Ser83Leu、Asp87Gly、Asp87His和Par C的Gly78Asp。外排泵基因acr A或者acr B基因缺失的菌株,其獲得低水平耐藥主要與靶位基因突變有關(guān),其獲得高水平耐藥主要由于與其存在功能冗余的外排泵Acr EF被激活,增加藥物外排所致。誘導(dǎo)耐藥發(fā)展過程中,菌株的膜孔蛋白Omp F的表達水平不斷下降,使得藥物進入細胞的通道減少。正向調(diào)控基因mar A和sox S缺失后,在環(huán)丙沙星選擇壓力下僅能篩選出對環(huán)丙沙星敏感性降低的菌株,而負調(diào)控基因mar R和sox R缺失后,在環(huán)丙沙星選擇壓力下能篩選出對環(huán)丙沙星的耐藥株。所有缺失株僅在gyr A發(fā)生單突變。以上結(jié)果說明mar A和sox S對Acr AB-Tol C的正向調(diào)控是通過解除了mar R和sox R對mar A和sox S的阻遏來實現(xiàn)的。本研究表明Acr AB-Tol C外排泵功能的完整性對細菌耐藥性發(fā)展發(fā)揮重要作用,當(dāng)其功能破壞,與其存在功能冗余的外排泵Acr EF發(fā)揮替代作用。
【關(guān)鍵詞】：大腸桿菌 基因敲除 AcrAB-TolC AcrEF 靶位突變
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要3-4
• abstract4-6
• 常用縮略詞6-9
• 1 前言9-15
• 1.1 細菌的耐藥機制9-10
• 1.2 主動外排泵系統(tǒng)與多重耐藥（MDR，Multi Drug Resistance）10-11
• 1.3 靶位基因突變及主動外排系統(tǒng)對氟喹諾酮類耐藥的作用11-12
• 1.4 外膜蛋白12-13
• 1.5 基因敲除技術(shù)在外排泵機制研究中的應(yīng)用13-15
• 2 材料和方法15-32
• 2.1 材料15-17
• 2.1.1 菌株及質(zhì)粒15
• 2.1.2 藥物、培養(yǎng)基及主要試劑15-16
• 2.1.3 常用試劑的配制16
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備16-17
• 2.2 大腸桿菌K12外排泵及調(diào)控基因缺失株的構(gòu)建17-23
• 2.2.1 菌株的復(fù)蘇17
• 2.2.2 大腸桿菌K12電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備17-18
• 2.2.3 質(zhì)粒的提取18
• 2.2.4 電轉(zhuǎn)化18-19
• 2.2.5 含質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌K12感受態(tài)細胞的制備19
• 2.2.6 Kan或Chl抗性基因片段的制備19-22
• 2.2.7 電轉(zhuǎn)化22-23
• 2.3 外排泵及調(diào)控基因缺失株功能的研究23-32
• 2.3.1 原菌K12及基因缺失株生長特性的測定23
• 2.3.2 二倍瓊脂稀釋法測定環(huán)丙沙星最小抑菌濃度（MICs）23-25
• 2.3.3 體外誘導(dǎo)及突變頻率的測定25
• 2.3.4 原菌、敲除菌及誘導(dǎo)菌靶位基因突變的檢測25-27
• 2.3.5 誘導(dǎo)突變株中外排泵相關(guān)基因表達水平檢測27-32
• 3 結(jié)果與分析32-46
• 3.1 成功構(gòu)建大腸桿菌K12外排泵及調(diào)控基因缺失株32-33
• 3.2 原菌及敲除菌生長特性測定結(jié)果33
• 3.3 原菌、敲除菌及誘導(dǎo)菌MIC測定及靶位基因突變檢測結(jié)果33-37
• 3.4 外排泵基因及相關(guān)基因表達水平檢測結(jié)果37-46
• 4 討論46-50
• 全文總結(jié)50-51
• 致謝51-52
• 參考文獻52-55

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