本文關(guān)鍵詞：人血白蛋白優(yōu)勢(shì)抗原表位的篩選及其在檢測(cè)中的應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人血白蛋白主要由人體肝臟產(chǎn)生,系血液中含量最高的蛋白質(zhì),是維系人體血液與組織間動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵物質(zhì),故其制品被廣泛地應(yīng)用于臨床多種疾病的治療,系“救命藥”之一。目前臨床應(yīng)用的人血白蛋白制品為注射劑(包含注射液和凍干粉),系以健康人血漿為原材料,經(jīng)低溫乙醇法分離、純化并滅活病毒后制備而來(lái)。近年,人血白蛋白生產(chǎn)原料(健康人血漿)緊缺,無(wú)法滿(mǎn)足生產(chǎn)需求,造成臨床人血白蛋白注射液供應(yīng)嚴(yán)重不足的現(xiàn)狀,也驅(qū)動(dòng)了不法者鋌而走險(xiǎn),通過(guò)假冒人血白蛋白來(lái)謀取非法暴利。由于假冒事件的頻發(fā),危害觸目驚心,已嚴(yán)重威脅到人民群眾的用藥安全。多年來(lái),制假者的制假手段不斷翻新,前期主要以化學(xué)成分冒充血液制品,目前已有以其他種屬來(lái)源的白蛋白冒充人血白蛋白的趨勢(shì),而可用于其鑒別的專(zhuān)屬、有效、快速的關(guān)鍵性方法尚無(wú),無(wú)法實(shí)現(xiàn)其真?zhèn)蔚目焖僬鐒e,給臨床用藥帶來(lái)巨大的安全隱患。本課題旨在發(fā)展并建立人血白蛋白快速甄別的有效專(zhuān)屬的關(guān)鍵性新方法。本研究在對(duì)人血白蛋白優(yōu)勢(shì)抗原表位進(jìn)行篩選的基礎(chǔ)上,利用分子生物學(xué)技術(shù),通過(guò)人工抗原合成和抗體構(gòu)建等系列研究,建立了可用于人血白蛋白快速甄別檢測(cè)的新方法,相關(guān)研究成果在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道,具有顯著的創(chuàng)新性和實(shí)用性。研究首先從基因序列入手,使用Biosun軟件分別對(duì)與人白蛋白編碼序列非常相似的豬,馬,牛,羊白蛋白同時(shí)進(jìn)行B細(xì)胞線性抗原表位的預(yù)測(cè),同時(shí)ClustalX對(duì)其序列差異性及同源性進(jìn)行比較,從中篩選三段抗原表位進(jìn)行克隆表達(dá)即126-162,314-355,373-424位氨基酸。采用中心模板法設(shè)計(jì)引物,PCR合成目的基因,與PGEX-4T-2載體連接后插入大腸桿菌HB101中IPTG誘導(dǎo)表達(dá),產(chǎn)物由SDS-PAGE電泳進(jìn)行初步鑒定后,測(cè)序法對(duì)序列正確性進(jìn)行驗(yàn)證,GST融合蛋白純化柱純化后獲得目的蛋白。對(duì)得到的目的蛋白通過(guò)間接ELISA法與人白蛋白抗體反應(yīng),對(duì)其抗原性進(jìn)行篩選;同時(shí)與豬,馬,牛,羊白蛋白抗體進(jìn)行交叉反應(yīng),對(duì)其特異性進(jìn)行篩選。將含有人白蛋白特異性抗原表位的重組抗原與人白蛋白通過(guò)免疫反應(yīng)制備得到兔多抗,辛酸-硫酸銨沉淀法純化血清得到抗體,通過(guò)IC50和Kids兩參數(shù)對(duì)兩種抗體的特異性和親和力進(jìn)行評(píng)價(jià)。將人白蛋白單抗作為包被單抗,實(shí)驗(yàn)制備得到的多抗為酶標(biāo)二抗,建立一種可用于人白蛋白定性及定量檢測(cè)的雙抗體夾心ELISA體系。分子克隆制備基因目的片段,PCR產(chǎn)物回收并酶切后經(jīng)DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定,分別在110,130,150bp處有目的條帶,與載體連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌HB101中,誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示,在30.1,30.6,31.7 kD分子量位置得到目的蛋白產(chǎn)物。經(jīng)間接ELISA法檢測(cè)可得,373-424位人白蛋白氨基酸序列為優(yōu)勢(shì)抗原表位序列,該表位所得到的抗體與人白蛋白抗體的IC50分別為1.635μg·mL-1,3.280μg·mL-1,Kids分別為2.438×10-11,4.211×10-10,即說(shuō)明優(yōu)勢(shì)抗原表位所制備的抗體特異性較高、親和性良好,基于此抗體建立的人白蛋白檢測(cè)體系可用于其定性定量檢測(cè)。綜上所述,本研究在編碼人白蛋白的609個(gè)氨基酸序列中,成功篩選得到了特異性抗原表位序列,并通過(guò)原核表達(dá)技術(shù)和體外免疫技術(shù)成功制備得了到針對(duì)特異性抗原表位的目的蛋白和多克隆抗體,建立了可用于人血白蛋白定性、定量的ELISA檢測(cè)體系,方法專(zhuān)屬、快速、有效,對(duì)于人血白蛋白制品的應(yīng)用質(zhì)量安全保障具有重大意義。
【關(guān)鍵詞】：人血白蛋白 抗原表位 基因克隆表達(dá) 間接ELISA 定性檢測(cè) 定量檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R927
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 英文縮寫(xiě)9-10
• 前言10-15
• 材料與方法15-29
• 結(jié)果29-34
• 附圖34-42
• 附表42-46
• 討論46-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 綜述 生物制品常用輔料及其限量檢測(cè)方法研究進(jìn)展56-77
• 參考文獻(xiàn)68-77
• 致謝77-78
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷78

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：人血白蛋白優(yōu)勢(shì)抗原表位的篩選及其在檢測(cè)中的應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：444120