本文關(guān)鍵詞：人血白蛋白優(yōu)勢抗原表位的篩選及其在檢測中的應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人血白蛋白主要由人體肝臟產(chǎn)生,系血液中含量最高的蛋白質(zhì),是維系人體血液與組織間動態(tài)平衡的關(guān)鍵物質(zhì),故其制品被廣泛地應用于臨床多種疾病的治療,系“救命藥”之一。目前臨床應用的人血白蛋白制品為注射劑(包含注射液和凍干粉),系以健康人血漿為原材料,經(jīng)低溫乙醇法分離、純化并滅活病毒后制備而來。近年,人血白蛋白生產(chǎn)原料(健康人血漿)緊缺,無法滿足生產(chǎn)需求,造成臨床人血白蛋白注射液供應嚴重不足的現(xiàn)狀,也驅(qū)動了不法者鋌而走險,通過假冒人血白蛋白來謀取非法暴利。由于假冒事件的頻發(fā),危害觸目驚心,已嚴重威脅到人民群眾的用藥安全。多年來,制假者的制假手段不斷翻新,前期主要以化學成分冒充血液制品,目前已有以其他種屬來源的白蛋白冒充人血白蛋白的趨勢,而可用于其鑒別的專屬、有效、快速的關(guān)鍵性方法尚無,無法實現(xiàn)其真?zhèn)蔚目焖僬鐒e,給臨床用藥帶來巨大的安全隱患。本課題旨在發(fā)展并建立人血白蛋白快速甄別的有效專屬的關(guān)鍵性新方法。本研究在對人血白蛋白優(yōu)勢抗原表位進行篩選的基礎(chǔ)上,利用分子生物學技術(shù),通過人工抗原合成和抗體構(gòu)建等系列研究,建立了可用于人血白蛋白快速甄別檢測的新方法,相關(guān)研究成果在國內(nèi)外尚未見報道,具有顯著的創(chuàng)新性和實用性。研究首先從基因序列入手,使用Biosun軟件分別對與人白蛋白編碼序列非常相似的豬,馬,牛,羊白蛋白同時進行B細胞線性抗原表位的預測,同時ClustalX對其序列差異性及同源性進行比較,從中篩選三段抗原表位進行克隆表達即126-162,314-355,373-424位氨基酸。采用中心模板法設(shè)計引物,PCR合成目的基因,與PGEX-4T-2載體連接后插入大腸桿菌HB101中IPTG誘導表達,產(chǎn)物由SDS-PAGE電泳進行初步鑒定后,測序法對序列正確性進行驗證,GST融合蛋白純化柱純化后獲得目的蛋白。對得到的目的蛋白通過間接ELISA法與人白蛋白抗體反應,對其抗原性進行篩選;同時與豬,馬,牛,羊白蛋白抗體進行交叉反應,對其特異性進行篩選。將含有人白蛋白特異性抗原表位的重組抗原與人白蛋白通過免疫反應制備得到兔多抗,辛酸-硫酸銨沉淀法純化血清得到抗體,通過IC50和Kids兩參數(shù)對兩種抗體的特異性和親和力進行評價。將人白蛋白單抗作為包被單抗,實驗制備得到的多抗為酶標二抗,建立一種可用于人白蛋白定性及定量檢測的雙抗體夾心ELISA體系。分子克隆制備基因目的片段,PCR產(chǎn)物回收并酶切后經(jīng)DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定,分別在110,130,150bp處有目的條帶,與載體連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌HB101中,誘導表達產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示,在30.1,30.6,31.7 kD分子量位置得到目的蛋白產(chǎn)物。經(jīng)間接ELISA法檢測可得,373-424位人白蛋白氨基酸序列為優(yōu)勢抗原表位序列,該表位所得到的抗體與人白蛋白抗體的IC50分別為1.635μg·mL-1,3.280μg·mL-1,Kids分別為2.438×10-11,4.211×10-10,即說明優(yōu)勢抗原表位所制備的抗體特異性較高、親和性良好,基于此抗體建立的人白蛋白檢測體系可用于其定性定量檢測。綜上所述,本研究在編碼人白蛋白的609個氨基酸序列中,成功篩選得到了特異性抗原表位序列,并通過原核表達技術(shù)和體外免疫技術(shù)成功制備得了到針對特異性抗原表位的目的蛋白和多克隆抗體,建立了可用于人血白蛋白定性、定量的ELISA檢測體系,方法專屬、快速、有效,對于人血白蛋白制品的應用質(zhì)量安全保障具有重大意義。
【關(guān)鍵詞】：人血白蛋白 抗原表位 基因克隆表達 間接ELISA 定性檢測 定量檢測
【學位授予單位】：河北北方學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R927
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 英文縮寫9-10
• 前言10-15
• 材料與方法15-29
• 結(jié)果29-34
• 附圖34-42
• 附表42-46
• 討論46-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻50-56
• 綜述 生物制品常用輔料及其限量檢測方法研究進展56-77
• 參考文獻68-77
• 致謝77-78
• 個人簡歷78

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：人血白蛋白優(yōu)勢抗原表位的篩選及其在檢測中的應用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：444120