本文關(guān)鍵詞：紡錘鏈霉菌SD-07與突變株所產(chǎn)抗生素特性比較及其胞外多糖的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：真菌感染在臨床上波及范圍廣,常用的抗真菌藥物有多烯大環(huán)內(nèi)酯類、唑類、棘球白素類、丙烯胺類、嘧啶類,每種藥物均存在一定的毒副作用,但研究發(fā)現(xiàn)多烯大環(huán)內(nèi)酯類類相對(duì)于其它種類藥物來(lái)說(shuō)其毒副作用相對(duì)較低,同時(shí)也是臨床上治療真菌感染的最后用藥。但長(zhǎng)期大量使用同樣具有導(dǎo)致腎功能衰竭和血栓性靜脈炎的毒性,因此尋找更為低毒的抗生素顯得尤為重要。紡錘鏈霉菌(Streptomycese netropsis) SD-07是本實(shí)驗(yàn)室2007年發(fā)現(xiàn)的一株新型菌株,其所產(chǎn)抗生素為多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,相比兩性霉素B,它具有更強(qiáng)的抗真菌活性。SD-07具有兩種高產(chǎn)突變株163和180,為驗(yàn)證三種菌株經(jīng)過(guò)5年傳代后菌株是否仍高產(chǎn),抗生素結(jié)構(gòu)及活性是否有變化,本論文對(duì)三種菌株所產(chǎn)抗生素進(jìn)行產(chǎn)量和活性的比較,同時(shí)對(duì)不同的純化方法進(jìn)行了活性、穩(wěn)定性和毒性比較。本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)鏈霉菌SD-07接合轉(zhuǎn)移體系的建立過(guò)程中發(fā)現(xiàn)Ca2+能夠極大地增加接合轉(zhuǎn)移的頻率,電鏡下觀察鏈霉菌SD-07菌體發(fā)現(xiàn)當(dāng)Ca2+存在時(shí)其胞外多糖的產(chǎn)生量明顯比不添加Ca2+時(shí)多。為更好的闡明胞外多糖與Ca2+以及接合轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系,本論文同時(shí)對(duì)SD-07胞外多糖的發(fā)酵和結(jié)構(gòu)解析進(jìn)行了相關(guān)研究。研究結(jié)果如下：1.抗生素相關(guān)研究結(jié)果紡錘鏈霉菌SD-07的180突變株是抗生素高產(chǎn)菌株,163菌株次之,相對(duì)于原始菌株SD-07,180抗生素產(chǎn)量是其3.33倍,163菌株是其1.28倍。高壓液相(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)。液相-質(zhì)譜分析(liquid chromatography-mass spectrum, LC-MS)和抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三種抗生素主要成分之間并無(wú)大的差別。不同的制備方法表明萃取法所制備的抗生素活性最為穩(wěn)定,分子篩所制備的抗生素最不穩(wěn)定。相隔三個(gè)月的抑菌性實(shí)驗(yàn)證明菌株180所產(chǎn)的抗生素粗品活性最高,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),抑菌活性增加,推測(cè)可能與溶解性有關(guān)。就細(xì)胞毒性試驗(yàn)來(lái)講中壓液相層析(Fast Pressure Liquid Chromatography, FPLC)是一種提純抗生素、降低毒性并提高抑菌性的好方法。SOS/umu-1acZ體系的致突變性檢測(cè)結(jié)果表明鏈霉菌所產(chǎn)生抗生素的體外致突變性為陰性,并與突變株類型和制備方法無(wú)關(guān)。2.胞外多糖相關(guān)研究結(jié)果胞外多糖產(chǎn)量最高時(shí)所用發(fā)酵時(shí)間為48h,培養(yǎng)基為R2YE,Ca2+對(duì)多糖的產(chǎn)生有明顯的促進(jìn)作用,Cu2+的抑制作用最為明顯,K+、Na+多糖產(chǎn)生幾乎沒(méi)有影響,Mg2+、Fe3+、Mn2+低濃度時(shí)促進(jìn)胞外多糖的產(chǎn)生。胞外粗多糖經(jīng)過(guò)醇沉和sevege法除蛋白后,隨后經(jīng)過(guò)DEAE纖維素陰離子交換柱及分子篩凝膠SephadexG-75分離得到純化多糖。多角度激光光散射儀分析得知多糖主要成分平均分子量約為32.29kDa。單糖組分分析表明,SD-07的胞外多糖由Fuc(巖藻糖)、Gal(半乳糖)、Glc(葡萄糖)和Man(甘露糖)組成,其中Fuc:Gal:Glc:Man=1.33:1.00:8.67:27.33。紅外光譜分析(Infrared Spectra Analysis, FTIR)結(jié)果證明多糖中含有甘露糖和葡萄糖,并且其構(gòu)型為p-D-葡萄糖和p-D-甘露糖。本論文研究結(jié)果：篩選出穩(wěn)定高產(chǎn)高活性菌株180,其抗生素組分及抑菌活性等性質(zhì)與原始菌株SD-07無(wú)顯著差異,提示180是未來(lái)抗生素生產(chǎn)的合適菌株。胞外多糖的產(chǎn)量與Ca2+的存在有關(guān)系,結(jié)構(gòu)解析結(jié)果為接合轉(zhuǎn)移和胞外多糖之間的關(guān)系提供了可靠數(shù)據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：抗生素 制備 特性比較 胞外多糖 結(jié)構(gòu)分析
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R914
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 第一章 前言12-26
• 1.1 研究背景及意義12-13
• 1.2 多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素13-18
• 1.2.1 作用機(jī)理14-15
• 1.2.2 抗生素制備15-18
• 1.2.2.1 結(jié)晶法16
• 1.2.2.2 色譜法16-17
• 1.2.2.3 溶劑萃取法17-18
• 1.2.2.4 離子交換法18
• 1.2.2.5 吸附法18
• 1.3 微生物胞外多糖18-24
• 1.3.1 微生物胞外多糖的應(yīng)用18-20
• 1.3.1.1 藥學(xué)領(lǐng)域19
• 1.3.1.2 農(nóng)業(yè)19-20
• 1.3.1.3 食品領(lǐng)域20
• 1.3.1.4 石油、化工20
• 1.3.2 多糖的結(jié)構(gòu)解析方法20-22
• 1.3.2.1 酸水解21
• 1.3.2.2 色譜法21
• 1.3.2.3 甲基化21-22
• 1.3.2.4 紅外光譜22
• 1.3.2.5 核磁共振(NMR)22
• 1.3.3 胞外多糖產(chǎn)生的影響因素22-23
• 1.3.4 SD-07胞外多糖與接合轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系23-24
• 1.4 本論文主要內(nèi)容及研究?jī)r(jià)值24-26
• 第二章 紡錘鏈霉菌SD-07及其突變株所產(chǎn)抗生素特性比較26-52
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料26-29
• 2.1.1 菌種26
• 2.1.2 培養(yǎng)基26-28
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器28
• 2.1.4 試劑28-29
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法29-34
• 2.2.1 三種抗生素的提取與回收率29
• 2.2.2 三種抗生素的中壓液相分析29
• 2.2.3 三種抗生素的組分分析29-30
• 2.2.3.1 HPLC分析三種抗生素29-30
• 2.2.3.2 質(zhì)譜分析三種抗生素30
• 2.2.4 三種抗生素的抑菌活性30-31
• 2.2.5 三種制備方法制備抗生素31
• 2.2.5.1 中壓液相制備抗生素31
• 2.2.5.2 Sephadex LH-20制備抗生素31
• 2.2.5.3 正丁醇萃取制備抗生素31
• 2.2.6 三種方法所制備抗生素對(duì)人體內(nèi)兩種致病真菌的抑制作用31-32
• 2.2.7 三種方法所制備抗生素的細(xì)胞毒性比較32
• 2.2.8 三種方法所制備抗生素的致突變性比較32-33
• 2.2.9 菌種篩選與保存33-34
• 2.3 結(jié)果與討論34-50
• 2.3.1 三種抗生素的提取與得率34-35
• 2.3.2 三種抗生素的中壓液相分析35-36
• 2.3.3 三種抗生素的組分分析36-40
• 2.3.3.1 三種抗生素的高效液相分析36-39
• 2.3.3.2 三種抗生素的質(zhì)譜分析39-40
• 2.3.4 三種抗生素的抑菌活性結(jié)果比較40
• 2.3.5 三種方法所制備抗生素40-43
• 2.3.5.1 MPLC制備抗生素41
• 2.3.5.2 Sephadex LH-20制備抗生素41-42
• 2.3.5.3 正丁醇萃取制備抗生素42-43
• 2.3.6 三種方法所制備抗生素對(duì)人體內(nèi)兩種致病真菌的抑制作用43-45
• 2.3.7 三種方法所制備抗生素的細(xì)胞毒性比較45-47
• 2.3.8 三種方法所制備抗生素的致突變性比較47-49
• 2.3.9 菌種的篩選與保存49-50
• 2.4 本章總結(jié)50-52
• 第三章 紡錘鏈霉菌SD-07所產(chǎn)胞外多糖的特性研究及結(jié)構(gòu)解析52-80
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料52-56
• 3.1.1 菌種52
• 3.1.2 培養(yǎng)基52-55
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器55
• 3.1.4 試劑與凝膠55-56
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法56-60
• 3.2.1 苯酚-硫酸法[74]測(cè)定胞外多糖含量56-57
• 3.2.2 篩選多糖發(fā)酵時(shí)間57
• 3.2.3 不同陽(yáng)離子對(duì)多糖產(chǎn)量的影響57
• 3.2.4 篩選多糖發(fā)酵用培養(yǎng)基57-58
• 3.2.5 上清與菌體中多糖含量對(duì)比58
• 3.2.6 提取后表面多糖的除雜和分離純化58-59
• 3.2.7 純化后多糖分子量的測(cè)定59
• 3.2.8 純化后胞外多糖的酸解[77]及組分測(cè)定59
• 3.2.9 純化后多糖的紅外光譜分析59-60
• 3.3 結(jié)果與討論60-77
• 3.3.1 胞外多糖(EPS)測(cè)定方法的建立60
• 3.3.2 EPS產(chǎn)生的影響因素60-64
• 3.3.2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)EPS的影響60-61
• 3.3.2.2 金屬離子對(duì)EPS的影響61-63
• 3.3.2.3 培養(yǎng)基對(duì)EPS的影響63-64
• 3.3.3 EPS的制備64-68
• 3.3.3.1 發(fā)酵上清液與菌體多糖含量比較64-65
• 3.3.3.2 胞外多糖的分離純化65-68
• 3.3.4 EPS結(jié)構(gòu)解析(表征)68-77
• 3.3.4.1 多糖分子量的測(cè)定68-69
• 3.3.4.2 胞外多糖單糖組成分析69-73
• 3.3.4.3 紅外光譜分析結(jié)果73-74
• 3.3.4.4 NMR結(jié)果74-77
• 3.4 本章總結(jié)77-80
• 全文總結(jié)80-82
• 參考文獻(xiàn)82-90
• 致謝90-91
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表91

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