本文關(guān)鍵詞：南極海洋芽孢桿菌多肽PBN11-8的分離純化及抗腫瘤活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腫瘤是全球危害人類健康的最嚴重的疾病之一,抗腫瘤藥物具有巨大的市場需求,抗腫瘤先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)具有重要意義。極地是一個潛在、重要的微生物資源庫,是產(chǎn)生新型生物活性物質(zhì)和先導(dǎo)化合物的微生物潛在種源地。我們從南極不同站點采集的表層海水中分離獲得了大量微生物,以人肝癌細胞BEL-7402為模型,采用MTT活性跟蹤法,對獲得的微生物的代謝產(chǎn)物進行抗腫瘤活性的篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株N11-8的發(fā)酵代謝產(chǎn)物的抑制率達到68.1%。通過16S rRNA的序列分析和生理生化特征試驗,初步確定了N11-8菌株為芽孢桿菌屬(Bacillus)。隨后,采用MTT活性跟蹤法和SDS-PAGE凝膠電泳檢測,通過超濾,硫酸銨沉淀,強陰離子交換層析,高效液相層析,從南極海洋芽胞桿菌N11-8的發(fā)酵液中分離純化得到了一種具有抗腫瘤活性的多肽PBN11-8 (Peptide from Bacillus sp. N11-8),采用質(zhì)譜確定其分子量為19kDa,測定多肽N端15個氨基酸的序列是ASTGSQKVTVYAVAD. MTT法檢測發(fā)現(xiàn)PBN11-8對人肝癌細胞BEL-7402、人腎透明細胞腺癌細胞786-0、人卵巢癌細胞NIH:OVCAR-3和人大細胞肺癌細胞NCI-H460均具有較好的增殖抑制作用,IC50值分別為1.56、1.80、1.81和2.31μg/mL,但對人正常肝細胞L-02的增殖抑制作用相對較��；通過相差顯微鏡觀察,PBN11-8可以使BEL-7402細胞變圓,細胞體積皺縮變小,細胞間連接減少,最終導(dǎo)致細胞大部分脫落,細胞數(shù)量減少,并且隨著時間增加作用增強；通過細胞劃痕實驗和Transwell實驗驗證了PBN11-8能夠抑制BEL-7402細胞的遷移與侵襲。本研究分離的南極海洋微生物將為海洋活性化合物的發(fā)現(xiàn)提供新的南極微生物種質(zhì)資源；從海洋芽孢桿菌N11-8的代謝產(chǎn)物中純化的活性多肽PBN11-8有望成為一種新的抗腫瘤先導(dǎo)化合物,具有較好的應(yīng)用開發(fā)前景。
【關(guān)鍵詞】：南極海水 海洋細菌 篩選 多肽 抗腫瘤活性 分離純化
【學(xué)位授予單位】：青島科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96;R915
【目錄】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-9
• 引言9-11
• 第1章 緒論11-23
• 1.1 海洋抗腫瘤藥物11-17
• 1.1.1 海洋藥物概述11-12
• 1.1.2 抗腫瘤藥物的研究進展12-13
• 1.1.3 海洋微生物抗腫瘤活性物質(zhì)的研究進展13-14
• 1.1.4 海洋細菌是開發(fā)新型抗癌藥物的新來源14-17
• 1.2 天然抗腫瘤藥物的研究方法17-20
• 1.2.1 抗腫瘤藥物篩選的有效性研究17-18
• 1.2.2 活性物質(zhì)的純化與檢測18-20
• 1.3 抗腫瘤藥物作用機理20-22
• 1.3.1 以細胞凋亡為靶點20
• 1.3.2 以腫瘤新生血管為靶點20
• 1.3.3 MAPK信號通路20-21
• 1.3.4 微管抑制劑21-22
• 1.3.5 端粒酶22
• 1.4 選題的目的與研究內(nèi)容22-23
• 第2章 南極抗腫瘤微生物的篩選及菌種鑒定23-33
• 2.1 材料23-25
• 2.1.1 實驗材料23
• 2.1.2 試驗試劑23-24
• 2.1.3 培養(yǎng)基24
• 2.1.4 實驗儀器24-25
• 2.2 方法25-27
• 2.2.1 南極抗腫瘤微生物的篩選25-26
• 2.2.2 南極抗腫瘤微生物的菌種鑒定26-27
• 2.3 結(jié)果與分析27-31
• 2.3.1 南極抗腫瘤微生物的篩選結(jié)果27-28
• 2.3.2 菌株N11-8的菌種鑒定28-31
• 2.4 討論31-33
• 第3章 南極海洋芽孢桿菌多肽PBN11-8的分離純化33-47
• 3.1 材料33-35
• 3.1.1 實驗材料33
• 3.1.2 試驗試劑33
• 3.1.3 培養(yǎng)基33-34
• 3.1.4 溶劑34
• 3.1.5 實驗儀器34-35
• 3.2 方法35-39
• 3.2.1 南極海洋芽孢桿菌N11-8的發(fā)酵培養(yǎng)35
• 3.2.2 超濾處理35
• 3.2.3 硫酸銨沉淀處理35-36
• 3.2.4 離子交換色譜分離36
• 3.2.5 制備型高效液相色譜分離36-37
• 3.2.6 高效液相色譜檢測分離多肽的純度37
• 3.2.7 SDS-PAGE檢測分離多肽的純度37-38
• 3.2.8 ESI質(zhì)譜檢測分離多肽的分子量38
• 3.2.9 分離多肽的N-端氨基酸序列的測定38-39
• 3.3 結(jié)果與分析39-43
• 3.3.1 超濾得到活性組分39
• 3.3.2 硫酸銨沉淀得到活性組分39
• 3.3.3 離子交換色譜分離獲得活性組分39-40
• 3.3.4 制備型高效液相色譜分離獲得的活性組分40-41
• 3.3.5 高效液相色譜對PBN11-8的純度檢測41-42
• 3.3.6 SDS-PAGE對PBN11-8的純度檢測42-43
• 3.3.7 ESI質(zhì)譜對PBN11-8的分子量測定43
• 3.3.8 PBN11-8的N端氨基酸序列測定結(jié)果43
• 3.4 討論43-47
• 第4章 PBN11-8的抗腫瘤活性47-57
• 4.1 材料47-48
• 4.1.1 實驗材料47
• 4.1.2 實驗試劑47-48
• 4.1.3 實驗儀器48
• 4.2 方法48-50
• 4.2.1 PBN11-8對人肝癌細胞BEL-7402增殖的抑制作用48
• 4.2.2 PBN11-8對人卵巢癌細胞NIH：OVCAR-3增殖的抑制作用48
• 4.2.3 PBN11-8對人腎透明細胞腺癌細胞786-0增殖的抑制作用48-49
• 4.2.4 PBN11-8對人大細胞肺癌細胞NCl-H460增殖的抑制作用49
• 4.2.5 PBN11-8對人正常肝細胞L-02增殖的抑制作用49
• 4.2.6 PBN11-8對BEL-7402細胞形態(tài)變化的影響49
• 4.2.7 PBN11-8對BEL-7402細胞遷移和侵襲的影響49-50
• 4.3 結(jié)果與分析50-55
• 4.3.1 PBN11-8抑制BEL-7402的細胞增殖50-51
• 4.3.2 PBN11-8抑制NIH：OVCAR-3細胞增殖51
• 4.3.3 PBN11-8對786-0的細胞增殖有抑制作用51-52
• 4.3.4 PBN11-8對NCl-H460的細胞增殖有抑制作用52
• 4.3.5 PBN11-8對人正常肝癌細胞L-02的增殖抑制作用相對較小52-53
• 4.3.6 PBN11-8改變BEL-7402的細胞形態(tài)53-54
• 4.3.7 PBN11-8抑制BEL-7402的細胞遷移和侵襲54-55
• 4.4 討論55-57
• 本文結(jié)論57-59
• 參考文獻59-63
• 附錄63-67
• 1. 細胞的復(fù)蘇63
• 2 細胞傳代培養(yǎng)63
• 3 細胞計數(shù)63-64
• 4. 抗腫瘤活性檢測(MTT)64
• 5. 蛋白多肽濃度測定64-67
• 致謝67-69
• 攻讀學(xué)位期問發(fā)表學(xué)術(shù)論文目錄69-73

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