手足口病(Hand foot and mouth disease,HFMD)通常表現(xiàn)為5歲以下兒童常見的發(fā)熱性發(fā)疹性疾病,癥狀包括:手掌和足底,頰粘膜,舌頭和臀部的囊泡,其主要傳播病原體是人腸道病毒(Enterovirus71,EV71)。研究表明宿主細(xì)胞凋亡與病毒復(fù)制之間關(guān)系復(fù)雜,而已知EV71病毒顆粒感染宿主細(xì)胞后誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生,因此闡明凋亡在EV71病毒復(fù)制過程中的作用機(jī)制對(duì)我們應(yīng)用凋亡相關(guān)藥物抗手足口病至關(guān)重要。半胱天冬氨酸水解酶(Caspases-3)是參與細(xì)胞凋亡的重要因子,而凋亡影響病毒復(fù)制主要是通過影響病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白實(shí)現(xiàn)的。病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3C不僅在病毒蛋白的成熟過程中扮演關(guān)鍵角色,研究還表明,EV71通過非結(jié)構(gòu)性病毒蛋白3C激活Caspase-3以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡,然而,直到現(xiàn)在還不清楚3C如何激活Caspases以及Caspase激活到底是如何影響病毒的產(chǎn)生的。首先,我們探究了3C和Caspase蛋白激活之間的關(guān)系,研究對(duì)象為人肝癌細(xì)胞Hep G2,通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、核染色研究Hep G2轉(zhuǎn)染3C后引起的細(xì)胞病變效應(yīng)以及Caspase-3抑制劑對(duì)Hep G2轉(zhuǎn)染3C保...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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中文摘要
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縮略詞表
第1章 緒論
    1.1 研究背景
    1.2 EV71病毒結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和非結(jié)構(gòu)蛋白 3C研究進(jìn)展
    1.3 CASPASE激活調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡的機(jī)制探究
        1.3.1 EV71感染宿主細(xì)胞的凋亡研究狀況
        1.3.2 宿主細(xì)胞凋亡與病毒復(fù)制的關(guān)系
    1.4 抗EV71藥物研究進(jìn)展
第2章 材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料，儀器和試劑
        2.1.1 病毒和細(xì)胞
        2.1.2 質(zhì)粒和突變體的構(gòu)建
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 抗體
        2.1.5 主要試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及傳代
        2.2.2 病毒擴(kuò)增
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)分組
        2.2.4 使用Caspase抑制劑時(shí)處理過程
        2.2.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)及核染色
        2.2.6 lipo2000轉(zhuǎn)染法細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
        2.2.7 凝膠電泳和免疫印跡
        2.2.8 半胱天冬酶活性測(cè)定
        2.2.9 免疫共沉淀
        2.2.10 瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定DNA片段化
        2.2.11 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率
        2.2.12 使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)
        2.2.13 IL-6分泌的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）
        2.2.14 通過流式細(xì)胞法進(jìn)行細(xì)胞周期分析
        2.2.15 5'UTR質(zhì)粒構(gòu)建和螢光素酶測(cè)定
        2.2.16 定量實(shí)時(shí)RT PCR
        2.2.17 蔗糖墊超速離心法收獲病毒
        2.2.18 病毒滴度測(cè)定
        2.2.19 統(tǒng)計(jì)分析
第3章 結(jié)果與分析
    3.1 3C能夠引起細(xì)胞凋亡，結(jié)合并激活CASPASE-8、9 進(jìn)而激活CASPASE-3
        3.1.1 EV71感染和非結(jié)構(gòu)蛋白 3C引起細(xì)胞的病變效應(yīng)
        3.1.2 EV71的非結(jié)構(gòu) 3C蛋白酶結(jié)合Caspase-8 和Caspase-9 并介導(dǎo)caspase-3 的激活
    3.2 CASPASE-3 抑制劑抑制 3C轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞中的CASPASE-3 活化和并阻止細(xì)胞病變
        3.2.1 Caspase-3 抑制劑抑制 3C轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的Caspase-3 活化
        3.2.2 Caspase-3 抑制劑抑制 3C轉(zhuǎn)染的細(xì)胞病變效應(yīng)
    3.3 CASPASE-3 抑制劑保護(hù)RD細(xì)胞免于EV71感染誘導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)
        3.3.1 Caspase-3 抑制劑濃度最佳選擇
        3.3.2 Caspase-3 抑制劑抑制EV71感染細(xì)胞中的Caspase-3 活化
        3.3.3 Caspase-3 抑制劑避免EV71感染RD細(xì)胞病變效應(yīng)的出現(xiàn)
        3.3.4 Caspase-3 抑制劑抑制RD細(xì)胞炎癥因子釋放
        3.3.5 Caspase-3 抑制劑反轉(zhuǎn)EV71感染RD細(xì)胞引起的S期阻滯
    3.4 CASPASE-3 抑制劑抑制EV71感染性
        3.4.1 Caspase-3 抑制劑對(duì)病毒侵入和復(fù)制的影響
        3.4.2 Caspase-3 抑制劑對(duì)病毒蛋白VP1表達(dá)和病毒毒力的影響
第4章 討論
    4.1 CASPASE-3，8，9 與 3C之間的相互作用關(guān)系
    4.2 CASPASE-3 抑制劑通過抑制 3C活化CASPASE-3 阻止細(xì)胞病變
    4.3 CASPASE-3 抑制劑阻止宿主細(xì)胞的凋亡的發(fā)生
    4.4 CASPASE-3 抑制劑對(duì)EV71病毒感染性和毒力的影響
第5章 結(jié)論與創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
作者簡(jiǎn)介及碩士期間取得的成果
致謝



本文編號(hào)：3955687