手足口病(Hand foot and mouth disease,HFMD)通常表現(xiàn)為5歲以下兒童常見的發(fā)熱性發(fā)疹性疾病,癥狀包括:手掌和足底,頰粘膜,舌頭和臀部的囊泡,其主要傳播病原體是人腸道病毒(Enterovirus71,EV71)。研究表明宿主細胞凋亡與病毒復制之間關(guān)系復雜,而已知EV71病毒顆粒感染宿主細胞后誘導凋亡的發(fā)生,因此闡明凋亡在EV71病毒復制過程中的作用機制對我們應用凋亡相關(guān)藥物抗手足口病至關(guān)重要。半胱天冬氨酸水解酶(Caspases-3)是參與細胞凋亡的重要因子,而凋亡影響病毒復制主要是通過影響病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白實現(xiàn)的。病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3C不僅在病毒蛋白的成熟過程中扮演關(guān)鍵角色,研究還表明,EV71通過非結(jié)構(gòu)性病毒蛋白3C激活Caspase-3以誘導宿主細胞凋亡,然而,直到現(xiàn)在還不清楚3C如何激活Caspases以及Caspase激活到底是如何影響病毒的產(chǎn)生的。首先,我們探究了3C和Caspase蛋白激活之間的關(guān)系,研究對象為人肝癌細胞Hep G2,通過細胞形態(tài)學、核染色研究Hep G2轉(zhuǎn)染3C后引起的細胞病變效應以及Caspase-3抑制劑對Hep G2轉(zhuǎn)染3C保...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
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中文摘要
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縮略詞表
第1章 緒論
    1.1 研究背景
    1.2 EV71病毒結(jié)構(gòu)特點和非結(jié)構(gòu)蛋白 3C研究進展
    1.3 CASPASE激活調(diào)控宿主細胞凋亡的機制探究
        1.3.1 EV71感染宿主細胞的凋亡研究狀況
        1.3.2 宿主細胞凋亡與病毒復制的關(guān)系
    1.4 抗EV71藥物研究進展
第2章 材料和方法
    2.1 實驗材料，儀器和試劑
        2.1.1 病毒和細胞
        2.1.2 質(zhì)粒和突變體的構(gòu)建
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 抗體
        2.1.5 主要試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 細胞復蘇、培養(yǎng)及傳代
        2.2.2 病毒擴增
        2.2.3 實驗分組
        2.2.4 使用Caspase抑制劑時處理過程
        2.2.5 細胞形態(tài)學及核染色
        2.2.6 lipo2000轉(zhuǎn)染法細胞轉(zhuǎn)染實驗
        2.2.7 凝膠電泳和免疫印跡
        2.2.8 半胱天冬酶活性測定
        2.2.9 免疫共沉淀
        2.2.10 瓊脂糖凝膠電泳測定DNA片段化
        2.2.11 MTT法測定細胞增殖率
        2.2.12 使用血細胞計數(shù)器進行細胞計數(shù)
        2.2.13 IL-6分泌的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）
        2.2.14 通過流式細胞法進行細胞周期分析
        2.2.15 5'UTR質(zhì)粒構(gòu)建和螢光素酶測定
        2.2.16 定量實時RT PCR
        2.2.17 蔗糖墊超速離心法收獲病毒
        2.2.18 病毒滴度測定
        2.2.19 統(tǒng)計分析
第3章 結(jié)果與分析
    3.1 3C能夠引起細胞凋亡，結(jié)合并激活CASPASE-8、9 進而激活CASPASE-3
        3.1.1 EV71感染和非結(jié)構(gòu)蛋白 3C引起細胞的病變效應
        3.1.2 EV71的非結(jié)構(gòu) 3C蛋白酶結(jié)合Caspase-8 和Caspase-9 并介導caspase-3 的激活
    3.2 CASPASE-3 抑制劑抑制 3C轉(zhuǎn)染HEPG2細胞中的CASPASE-3 活化和并阻止細胞病變
        3.2.1 Caspase-3 抑制劑抑制 3C轉(zhuǎn)染的細胞中的Caspase-3 活化
        3.2.2 Caspase-3 抑制劑抑制 3C轉(zhuǎn)染的細胞病變效應
    3.3 CASPASE-3 抑制劑保護RD細胞免于EV71感染誘導的細胞病變效應
        3.3.1 Caspase-3 抑制劑濃度最佳選擇
        3.3.2 Caspase-3 抑制劑抑制EV71感染細胞中的Caspase-3 活化
        3.3.3 Caspase-3 抑制劑避免EV71感染RD細胞病變效應的出現(xiàn)
        3.3.4 Caspase-3 抑制劑抑制RD細胞炎癥因子釋放
        3.3.5 Caspase-3 抑制劑反轉(zhuǎn)EV71感染RD細胞引起的S期阻滯
    3.4 CASPASE-3 抑制劑抑制EV71感染性
        3.4.1 Caspase-3 抑制劑對病毒侵入和復制的影響
        3.4.2 Caspase-3 抑制劑對病毒蛋白VP1表達和病毒毒力的影響
第4章 討論
    4.1 CASPASE-3，8，9 與 3C之間的相互作用關(guān)系
    4.2 CASPASE-3 抑制劑通過抑制 3C活化CASPASE-3 阻止細胞病變
    4.3 CASPASE-3 抑制劑阻止宿主細胞的凋亡的發(fā)生
    4.4 CASPASE-3 抑制劑對EV71病毒感染性和毒力的影響
第5章 結(jié)論與創(chuàng)新點
參考文獻
作者簡介及碩士期間取得的成果
致謝



本文編號：3955687