研究背景：骨肉瘤(Osteosarcoma)源于間葉組織,是以能產生骨樣組織的梭形基質細胞為特征的惡性腫瘤,是原發(fā)性惡性骨腫瘤中最常見、惡性程度最高的一類骨腫瘤,好發(fā)于兒童和青少年期。在手術切除的基礎上輔助阿霉素(Adriamycin, ADR)藥物為主的聯(lián)合化療是目前臨床主要治療手段。盡管新型輔助化療的應用極大地提高了骨肉瘤患者的5年存活率,但是骨肉瘤患者的預后一直很差,長期生存率仍徘徊不前。骨肉瘤易復發(fā)、易轉移及患者對包括阿霉素在內的化療藥物產生原發(fā)或繼發(fā)性耐藥是目前導致臨床化療失敗的主要原因。根據(jù)腫瘤干細胞理論,骨肉瘤腫瘤干細胞具有自我更新、強致瘤性、多向分化潛能、產生異質性腫瘤細胞及多重耐藥性的生物學特征,因此骨肉瘤腫瘤干細胞的存在可能是臨床化療失敗的關鍵原因之一。如果可以特異性的針對骨肉瘤腫瘤干細胞,尤其是化療作用下骨肉瘤腫瘤干細胞相關特性的改變,可為深入認識骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展提供新方向,并以此為基礎尋找和發(fā)現(xiàn)靶向骨肉瘤腫瘤干細胞的藥物,對于骨肉瘤的最終治愈具有不可估量的前景和價值。本論文通過考察一線化療藥物阿霉素對骨肉瘤腫瘤干細胞特性和轉移能力的影響,發(fā)現(xiàn)人類Kruppel樣...

【文章頁數(shù)】：148 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
致謝
中文摘要
Abstract
目次
緒論
第一部分 阿霉素影響骨肉瘤腫瘤干細胞特性及轉移能力的作用及機制研究
    1.1 引言
    1.2 實驗材料與儀器
        1.2.1 細胞株和病人原代樣本
        1.2.2 質粒
        1.2.3 藥物與主要試劑
        1.2.5 實驗儀器與主要材料
    1.3 實驗方法
        1.3.1 細胞培養(yǎng)
        1.3.2 SRB法檢測
        1.3.3 流式細胞術檢測骨肉瘤細胞表面抗原CD133表達情況
        1.3.4 干細胞球的培養(yǎng)
        1.3.5 Real-time PCR測定細胞相關基因表達水平的變化
        1.3.6 細胞劃痕修復實驗
        1.3.7 Transwell小室細胞遷移實驗
        1.3.8 Western Blotting檢測相關蛋白表達水平
        1.3.9 SiRNA技術沉默骨肉瘤KHOS/NP細胞的Klf-4
        1.3.10 慢病毒的包裝、滴度測定及靶細胞轉染
        1.3.11 數(shù)據(jù)分析
    1.4 實驗結果
        1.4.1 ADR對骨肉瘤腫瘤干細胞特性的影響
        1.4.2 ADR對骨肉瘤細胞轉移能力的影響
        1.4.3 ADR對干細胞轉錄因子的影響
        1.4.4 Klf-4對ADR促進的骨肉瘤腫瘤干細胞特性的影響
        1.4.5 Klf-4對ADR促進的骨肉瘤細胞轉移能力的影響
    1.5 討論
第二部分 Klf-4調控骨肉瘤脾瘤干細胞特性及轉移能力的作用研究
    2.1 引言
    2.2 實驗材料與儀器
        2.2.1 細胞株
        2.2.2 質粒
        2.2.3 藥物與主要試劑
        2.2.4 實驗動物
        2.2.5 實驗儀器及主要材料
    2.3 實驗方法
        2.3.1 細胞培養(yǎng)
        2.3.2 臺盼藍拒染法檢測細胞增殖活性
        2.3.3 干細胞球的培養(yǎng)
        2.3.4 細胞周期和凋亡檢測
        2.3.5 細胞劃痕修復實驗
        2.3.6 Transwell小室細胞遷移實驗
        2.3.7 Western Blotting檢測相關蛋白表達水平
        2.3.8 SRB法檢測
        2.3.9 qRT-PCR測定相關基因表達水平的變化
        2.3.10 質粒轉化
        2.3.11 慢病毒的包裝、滴度測定及靶細胞轉染
        2.3.12 SiRNA技術沉默骨肉瘤KHOS/NP細胞的Klf-4和p38
        2.3.13 軟瓊脂糖克隆形成實驗
        2.3.14 裸小鼠異位移植瘤模型評價骨肉瘤細胞成瘤能力
        2.3.15 基因芯片分析
        2.3.16 數(shù)據(jù)分析
    2.4 實驗結果
        2.4.1 Klf-4在不同骨肉瘤細胞中的表達情況
        2.4.2 Klf-4的蛋白對骨肉瘤腫瘤干細胞特性的影響
        2.4.3 Klf-4的蛋白對骨肉瘤細胞周期和增殖能力的影響
        2.4.4 Klf-4的蛋白對骨肉瘤細胞化療敏感性的影響
        2.4.5 Klf-4的蛋白表達對骨肉瘤細胞轉移能力的影響
        2.4.6 p38 MAPK信號通路對Klf-4調控的骨肉瘤腫瘤干細胞特性的影響
    2.5 討論
第三部分 辛伐他汀通過抑制Klf-4蛋白拮抗ADR促進的骨肉瘤腫瘤干細胞特性
    3.1 引言
    3.2 實驗材料與儀器
        3.2.1 細胞株
        3.2.2 質粒
        3.2.3 藥物與主要試劑
        3.2.4 實驗動物
        3.2.5 實驗儀器與主要材料
    3.3 實驗方法
        3.3.1 細胞培養(yǎng)
        3.3.2 流式細胞術檢測骨肉瘤細胞表面抗原CD133表達情況
        3.3.3 干細胞球培養(yǎng)
        3.3.4 Real-time PCR測定細胞相關基因表達水平的變化
        3.3.5 細胞劃痕修復實驗
        3.3.6 Transwell小室細胞遷移實驗
        3.3.7 Western Blotting檢測相關蛋白表達水平
        3.3.8 慢病毒包裝、滴度測定及靶細胞轉染
        3.3.9 裸小鼠異位移植瘤模型評價骨肉瘤細胞成瘤能力
        3.3.10 免疫組化
        3.3.11 移植瘤的免疫熒光染色
        3.3.12 數(shù)據(jù)分析
    3.4 實驗結果
        3.4.1 他汀類藥物可以抑制Klf-4蛋白進而影響細胞sphere形成能力
        3.4.2 辛伐他汀藥物可以拮抗ADR促進的骨肉瘤腫瘤干細胞特性
        3.4.3 辛伐他汀藥物可以拮抗ADR促進的骨肉瘤細胞轉移能力
        3.4.4 辛伐他汀通過抑制Klf-4拮抗ADR所促進的骨肉瘤細胞成瘤性
    3.5 討論
參考文獻
綜述 腫瘤干細胞研究進展
    參考文獻
作者簡歷及在學期間所獲得的科研成果



本文編號：3886934