背景和目的:中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)是工業(yè)生產(chǎn)重組蛋白類生物藥物最主要的細(xì)胞株,2016年全球銷量排名前十的生物藥物中,有7個都是利用CHO系統(tǒng)表達(dá)生產(chǎn)的。這主要得益于以下幾個方面:CHO細(xì)胞具有與人體相似的復(fù)雜的翻譯后修飾功能,可以進行糖基化等翻譯后修飾,從而產(chǎn)生具有良好生物活性的重組蛋白;作為鼠源的CHO細(xì)胞可以避免人類細(xì)胞特異性病毒的污染;CHO細(xì)胞已實現(xiàn)無血清馴化培養(yǎng)和懸浮式高密度生長,能夠很好地滿足工業(yè)生產(chǎn)需求。目前工業(yè)構(gòu)建重組蛋白工程細(xì)胞株的一般方法,是將攜帶有目的基因的載體轉(zhuǎn)染進入宿主細(xì)胞,通過多輪的加壓篩選及鑒定,最終篩選得到隨機整合目的基因并能夠高效表達(dá)的細(xì)胞株。該方法耗時較長,一般需要6¹2個月,篩選工作量和難度均較大,此外,由于“位置效應(yīng)”的影響,隨著培養(yǎng)時間的延長,一些高產(chǎn)細(xì)胞株會出現(xiàn)產(chǎn)量下降的不穩(wěn)定現(xiàn)象。通過篩選高效穩(wěn)定的整合位點,將定點整合技術(shù)應(yīng)用于工業(yè)細(xì)胞株的建立是解決以上問題的理想途徑。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因定點整合技術(shù),是通過CRISPR/Cas9核酸酶使基因組在特定位點發(fā)生雙鏈斷裂,當(dāng)攜帶有同源臂及外源基因的供體載體...

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞
第一章 緒論
    1.1 抗體藥物及生產(chǎn)現(xiàn)狀
        1.1.1 抗體藥物簡介
        1.1.2 抗體藥物的生產(chǎn)現(xiàn)狀
    1.2 基因定點整合技術(shù)的研究進展
        1.2.1 基因定點整合技術(shù)簡介
        1.2.2 基因定點整合技術(shù)的研究現(xiàn)狀
    1.3 CRISPR/Cas9 技術(shù)在基因定點整合中的應(yīng)用
        1.3.1 CRISPR/Cas9 技術(shù)簡介
        1.3.2 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因定點整合技術(shù)的研究現(xiàn)狀
第二章 CHO-S細(xì)胞mCherry基因及anti-PD1 基因定點整合細(xì)胞株的篩選和鑒定
    2.1 引言
    2.2 材料和試劑
        2.2.1 實驗材料
        2.2.2 主要儀器和設(shè)備
        2.2.3 主要試劑
    2.3 實驗方法和結(jié)果
        2.3.1 sgRNA的設(shè)計及編輯效率的檢測
        2.3.2 供體質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
        2.3.4 細(xì)胞篩選和鑒定
        2.3.5 單克隆細(xì)胞的篩選和鑒定
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 sgRNA的設(shè)計及編輯效率的檢測
        2.4.2 供體質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.4.3 細(xì)胞篩選和鑒定
        2.4.4 單克隆細(xì)胞的篩選和鑒定
    2.5 討論
第三章 CHO-S細(xì)胞基因定點整合細(xì)胞株的性質(zhì)評價
    3.1 引言
    3.2 材料和試劑
        3.2.1 實驗材料
        3.2.2 主要儀器和設(shè)備
        3.2.3 主要試劑
    3.3 實驗方法
        3.3.1 生長性質(zhì)的比較
        3.3.2 轉(zhuǎn)錄水平的檢測
        3.3.3 脫靶效率的檢測
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.1 野生型細(xì)胞株和定點整合細(xì)胞株的生長性質(zhì)比較
        3.4.2 野生型細(xì)胞株、定點整合細(xì)胞株和隨機整合細(xì)胞株的基因轉(zhuǎn)錄水平比較
        3.4.3 定點整合細(xì)胞株的脫靶效率評價
    3.5 討論
第四章 CHO-S穩(wěn)定整合細(xì)胞株表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性及質(zhì)量評價
    4.1 引言
    4.2 材料和試劑
        4.2.1 實驗材料
        4.2.2 主要儀器和設(shè)備
        4.2.3 主要試劑
    4.3 實驗方法
        4.3.1 蛋白表達(dá)量的檢測和穩(wěn)定性的評價
        4.3.2 anti-PD1 蛋白的親和力分析
        4.3.3 anti-PD1 蛋白的糖基化分析
    4.4 實驗結(jié)果
        4.4.1 蛋白表達(dá)量的檢測和穩(wěn)定性的評價
        4.4.2 anti-PD1 蛋白的親和力分析
        4.4.3 anti-PD1 蛋白的糖基化分析
    4.5 討論
第五章 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻
致謝
攻讀碩士期間的成果



本文編號：3790387