本文關鍵詞：新型化合物XN51對急性粒細胞白血病細胞的作用與其影響熱休克蛋白90功能的關系，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的研究新型化合物XN51對急性粒細胞白血病(AML)細胞增殖抑制作用及其干擾熱休克蛋白90(Hsp90)功能的關系。方法(1)采用臺盼藍染色活細胞計數(shù)和MTT方法檢測XN51在體外抑制AML細胞增殖作用。(2)采用流式細胞術檢測XN51對AML細胞周期時相、線粒體膜電位(MMP)和細胞凋亡的影響。(3)蛋白免疫印跡(Western blot)探討XN51對AML細胞周期和細胞凋亡相關蛋白表達的影響。(4)孔雀綠磷鉬酸銨——無機磷檢測法檢測XN51對HSP90蛋白ATP酶活性的影響。(5)蛋白免疫印跡法檢測XN51對AML細胞Hsp90客戶蛋白Akt和CDK2表達的影響。結果(1)臺盼藍染色實驗和MTT實驗結果表明XN51具有明顯抑制AML細胞HL-60和NB4增殖的作用,半數(shù)抑制率濃度IC50分別為(3.49±0.02)μmol·L-1和(2.52±0.04)μmol·L-1,且其體外抑制AML細胞增殖的活性比Nov提高了近100倍。(2)流式細胞術結果表明XN51明顯增加HL-60和NB4細胞S期細胞的比例,使AML細胞周期阻滯在細胞周期S期;XN51能顯著降低AML細胞線粒體膜電位水平;隨著XN51濃度的增加,HL-60和NB4細胞的凋亡比例明顯增加;XN51破壞了AML細胞線粒體的穩(wěn)定性和增加AML細胞的凋亡率表明XN51通過激活細胞線粒體凋亡途徑誘導AML細胞發(fā)生程序性死亡或壞死;XN51處理AML細胞誘導Hsp70蛋白表達,增加細胞內(nèi)Cleaved parp、Cleaved Caspase3和Cleaved Caspase9蛋白蛋白含量,而下調(diào)p-Akt和CDK2蛋白的表達水平。(3)孔雀綠磷鉬酸銨——無機磷實驗結果表明XN51和Hsp90抑制劑GA(陽性對照藥)均能顯著抑制Hsp90 ATPase酶活性,表現(xiàn)為使Hsp90內(nèi)源熒光發(fā)生規(guī)律性淬滅。通過Stern—Volmer方程計算得出XN51對Hsp90ATPase作用的動態(tài)淬滅速率常數(shù)Kq值為(4.45±0.70x1012)L?mol-1?s-1遠大于各類淬滅劑對生物大分子最大擴散控制的碰撞動態(tài)淬滅速率常數(shù)Kq(2.0x1010L?mol-1?s-1),表明XN51是通過與Hsp90形成復合物引起Hsp90內(nèi)源熒光發(fā)生靜態(tài)淬滅達到體外抑制Hsp90 ATPase的催化活性的作用;XN51通過抑制Hsp90分子伴侶功能,使Akt蛋白不能形成正確穩(wěn)定的活性構象而被蛋白酶體降解,達到抑制AML細胞增殖作用;XN51通過抑制Hsp90分子伴侶功能,使CDK2蛋白不能形成正確穩(wěn)定的構象結構而被蛋白酶體降解,使AML細胞周期阻滯在S期;XN51在抑制Hsp90功能的同時使Hsp90的輔伴侶分子Hsp70蛋白表達上調(diào)。結論新型化合物XN51通過與Hsp90結合,干擾Hsp90分子伴侶功能,使參與細胞周期和增殖相關的Hsp90客戶蛋白Akt和CDK2不能正確折疊修飾形成有效穩(wěn)定的生物學構象而失活,依賴蛋白酶體通路在細胞內(nèi)被降解清除,使AML細胞周期進程不能通過S期細胞周期檢測點,誘導AML細胞阻滯在細胞周期的S期;XN51通過破壞線粒體膜電位的穩(wěn)定性,激活AML細胞線粒體凋亡通路,激活AML細胞內(nèi)Caspase級聯(lián)反應,誘導AML細胞發(fā)生凋亡,抑制AML細胞增殖。
【關鍵詞】：Hsp90 靜態(tài)淬滅 分子伴侶 細胞周期阻滯 凋亡
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 英文縮略詞表11-12
• 前言12-13
• 1. XN51對AML細胞增殖的抑制作用13-28
• 1.1 XN51的化學合成13-15
• 1.1.1 材料、試劑13
• 1.1.2 實驗儀器13-14
• 1.1.3 實驗方法14-15
• 1.1.3.1 藥物合成14
• 1.1.3.2 藥物純化14-15
• 1.2 臺盼藍染色活細胞計數(shù)15-17
• 1.2.1 材料、試劑15
• 1.2.2 細胞株及培養(yǎng)條件15
• 1.2.3 主要試劑的配制15
• 1.2.4 實驗儀器15-16
• 1.2.5 實驗方法16
• 1.2.6 實驗結果16-17
• 1.3 MTT法檢測XN51對AML細胞增殖抑制作用17-20
• 1.3.1 材料、試劑17
• 1.3.2 細胞株及培養(yǎng)條件17-18
• 1.3.3 主要試劑的配制18
• 1.3.4 實驗儀器18
• 1.3.5 實驗方法18-19
• 1.3.6 實驗結果19-20
• 1.4 XN51對AML細胞周期、線粒體膜電位和細胞凋亡的影響20-27
• 1.4.1 材料、試劑21
• 1.4.2 細胞株及培養(yǎng)條件21
• 1.4.3 主要試劑的配制21-22
• 1.4.4 實驗儀器22
• 1.4.5 實驗方法22-23
• 1.4.5.1 碘化丙啶染色流式細胞儀檢測細胞周期22
• 1.4.5.2 JC-1 染色檢測XN51對AML細胞線粒體膜電位的影響22-23
• 1.4.5.3 流式細胞儀檢測XN51對AML細胞凋亡的影響23
• 1.4.6 實驗結果23-27
• 1.4.6.1 XN51使HL-60和NB4細胞周期阻滯在S期23-25
• 1.4.6.2 XN51降低HL-60和NB4細胞線粒體膜電位25-26
• 1.4.6.3 XN51增加HL-60和NB4細胞凋亡比例26-27
• 1.5 統(tǒng)計分析27
• 1.6 討論和結論27-28
• 1.6.1 討論27-28
• 1.6.2 結論28
• 2 XN51抑制AML細胞增殖與其影響Hsp90功能的關系28-42
• 2.1 XN51對AML細胞周期及凋亡相關蛋白表達的影響28-34
• 2.1.1 材料、試劑29
• 2.1.2 細胞株及培養(yǎng)條件29
• 2.1.3 主要試劑的配制29-31
• 2.1.4 實驗儀器31
• 2.1.5 實驗方法31-33
• 2.1.5.1 提取總蛋白31-32
• 2.1.5.2 BCA蛋白定量32
• 2.1.5.3 蛋白免疫印跡32-33
• 2.1.6 實驗結果33-34
• 2.2 (孔雀綠磷鉬酸銨——無機磷檢測法)檢測XN51對HSP90蛋白ATP酶活性的影響34-36
• 2.2.1 材料、試劑34
• 2.2.2 主要試劑的配制34-35
• 2.2.3 實驗儀器35
• 2.2.4 實驗方法35-36
• 2.2.4.1 Hsp90蛋白的表達和純化35
• 2.2.4.2 熒光滴定法檢測XN51對Hsp90內(nèi)源熒光的淬滅作用35-36
• 2.2.5 實驗結果36
• 2.3 XN51對Hsp90客戶蛋白的影響36-38
• 2.3.1 實驗原理和材料36-37
• 2.3.2 實驗試劑37
• 2.3.3 試驗方法37
• 2.3.4 實驗結果37-38
• 2.4 統(tǒng)計分析38
• 2.5 討論和結論38-42
• 2.5.1 討論38-40
• 2.5.2 結論40-42
• 參考文獻42-46
• 文獻綜述46-53
• 參考文獻50-53
• 致謝53

【共引文獻】

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  本文關鍵詞：新型化合物XN51對急性粒細胞白血病細胞的作用與其影響熱休克蛋白90功能的關系，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：378500