發(fā)布時間：2017-05-15 11:01

  本文關(guān)鍵詞：啟動自身免疫的多靶向抗腫瘤復(fù)合制劑研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:腫瘤疫苗開發(fā)成本高昂且腫瘤細(xì)胞有免疫逃逸等特性,本研究在抗原-抗體結(jié)合和受配體結(jié)合理論的基礎(chǔ)上,引入新的免疫原(DOX-BSA)刺激機體產(chǎn)生抗DOX抗體,并在小分子(FA-DOX)橋聯(lián)作用下靶向腫瘤細(xì)胞,以期得到一種可增強腫瘤細(xì)胞免疫原性的廉價復(fù)合物大分子達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞并長期檢測的目的。免疫療法毒副作用小且效果持久溫和,但免疫治療周期較長,為防止腫瘤過度發(fā)展,因此在免疫治療前期介入Fu泡囊給藥系統(tǒng)抑制腫瘤的發(fā)展進程,提高治療效果。方法:1)通過縮醛法合成制備泡囊所需高分子材料F127-Chol并對其進行純化和鑒別。2)溶劑注入法制備Fu泡囊,分別采用超濾離心法和透析法測定包封率,以粒徑和包封率為評價指標(biāo),采用單因素考察法對泡囊的處方及其制備工藝進行優(yōu)化,對制備的泡囊的粒徑、電位、包封率進行測定,通過透射電鏡觀察制備的泡囊的形態(tài),對泡囊在模擬正常體液和模擬癌細(xì)胞環(huán)境的釋放規(guī)律進行考察。3)為考察泡囊在體外的抗腫瘤活性,以鼠源性乳腺腫瘤細(xì)胞4T1為腫瘤模型細(xì)胞,通過細(xì)胞毒性試驗(MTT法)考察泡囊殺死腫瘤細(xì)胞的能力,并進一步通過流式細(xì)胞儀檢測與藥物共包載于泡囊內(nèi)的熒光物質(zhì)羅丹明G6的攝取量,考察泡囊進入腫瘤細(xì)胞的能力。4)以4T1細(xì)胞、5-6周齡的雌性balb/c小鼠建立動物模型,以瘤體積增長倍數(shù)和抑瘤率為指標(biāo),考察泡囊實際的抗腫瘤效果。5)為獲得所需免疫原,以戊二醛交聯(lián)法合成外源性半抗原DOX-BSA,以透析法純化后,通過紫外-可見分光光度法和傅里葉轉(zhuǎn)換紅外分光光度法對其進行鑒別。6)為評估所得免疫原的免疫原性,以5-6周齡的雌性balb/c小鼠為模型動物,制備多克隆抗體,并通過ELISA以游離DOX競爭抑制后測定,繪制相應(yīng)抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線。7)合成分子橋FA-DOX,以不良溶劑沉淀純化后,通過液-質(zhì)聯(lián)用和核磁共振法對其進行鑒定。8)為證實免疫復(fù)合物大分子的存在及分子橋在免疫復(fù)合物形成過程中的作用,以4T1細(xì)胞為模型細(xì)胞,含抗阿霉素抗體的小鼠抗血清為抗體,二抗-HRP為檢測信號標(biāo)志物,測定其細(xì)胞酶聯(lián)免疫吸附分析法的吸光度值,考察腫瘤細(xì)胞FR~FA-DOX~抗血清~二抗-HRP免疫復(fù)合物的形成;為考察FA-DOX分子橋的主動靶向功能及化療效果,分別進行了流式細(xì)胞攝取試驗、熒光顯微鏡和細(xì)胞毒性試驗。9)為考察免疫治療聯(lián)合化療的抗腫瘤效果,以4T1細(xì)胞、5-6周齡的雌性balb/c小鼠建立動物模型,以瘤體積增長倍數(shù)和抑瘤率為指標(biāo),考察該復(fù)合療法實際的抗腫瘤效果;以組織切片圖譜為基礎(chǔ),考察不同給藥組別對腫瘤細(xì)胞的殺傷情況以及其對其他器官的毒性。結(jié)果:1)制備的材料純化后,經(jīng)傅里葉轉(zhuǎn)換紅外分光光度法和核磁共振氫譜結(jié)果均證明成功合成了高分子材料F127-Chol。2)制得的泡囊為較規(guī)整球形,平均粒徑(240.4?10.07)nm,Zeta電位-68.37 m V,FALT為1.83 nm;包封率32.76%;體外釋放符合Weibull模型,在模擬正常體液的環(huán)境中釋放藥物明顯減緩(t1/2為游離Fu的3.47倍)。3)細(xì)胞毒性試驗(MTT法)結(jié)果顯示,泡囊對4T1的細(xì)胞毒性呈現(xiàn)時間及濃度依賴性,24 h時各組IC50(μg.ml-1)值分別為:泡囊38.02±1.93;以市售材料制備的對照泡囊71.78±2.17;空白泡囊+游離藥物193.57±2.29;游離藥物207.068±3.58;空白泡囊927.14±5.93。流式細(xì)胞攝取術(shù)結(jié)果顯示,細(xì)胞攝取:泡囊空白泡囊+藥≈游離藥物。4)荷瘤鼠在給藥第23天時,泡囊組、對照泡囊組、Fu組和生理鹽水組的腫瘤體積增長倍數(shù)分別為64.44、81.16、105.87、150.28,算得各組抑瘤率依次為52.49%、33.90%和20.85%,泡囊組均明顯高于對照泡囊組及Fu組(p0.05)。5)制備的免疫原DOX-BSA純化后,經(jīng)紫外-可見風(fēng)光光度法和傅里葉轉(zhuǎn)換紅外分光光度法分析,均表明DOX-BSA合成成功。6)ELISA法證實,獲得的多克隆抗體能明顯被DOX競爭性抑制,且其IC50值為75.77±2.81 ng.ml-1,完全達(dá)到本研究所需靈敏度。7)液相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測和核磁共振氫譜均證明分子橋FA-DOX合成成功。8)細(xì)胞ELISA試驗中,FA-DOX+抗血清組FA-DOX+陰性血清組FA+DOX+抗血清組PBS組FA-DOX+PBS組,分別為FA-DOX+陰性血清組的1.76、FA+DOX+抗血清組的2.13、PBS組的2.45和FA-DOX+PBS組的2.87倍;除FA-DOX+抗血清組外其余各組與PBS組比較均無顯著性差異(P均0.05),證明了目標(biāo)大分子免疫復(fù)合物的存在,且抗體和FA-DOX在該復(fù)合物中缺一不可。流式細(xì)胞攝取術(shù)結(jié)果顯示,給藥2 h時各組細(xì)胞攝取阿霉素含量的規(guī)律為:FA-DOX組FA+FA-DOX組DOX,且FA-DOX組為DOX組的1.45倍,為FA+FA-DOX的1.05倍,說明分子橋FA-DOX有明顯的靶向功能,且游離葉酸的加入可限制分子橋的攝入。熒光顯微鏡檢測結(jié)果表明:各組細(xì)胞內(nèi)熒光強度均隨時間延長而增強,表明隨著時間進展藥物的攝取量增加,其中,2 h時,各組攝取均較少,因此,組間差異并未明顯體現(xiàn)出來,與流式細(xì)胞攝取術(shù)結(jié)果吻合。4 h時,FA-DOX組的攝取量分別為DOX組的2.09倍和FA+FA-DOX組的1.71倍,顯著高于DOX組和FA+FA-DOX組;另外,FA+FA-DOX組僅為DOX組的1.22倍,說明FA-DOX進入細(xì)胞通過FA介導(dǎo)的FA-FR途徑,且受游離FA的競爭性抑制。6 h的結(jié)果與4 h類似,其中,FA-DOX組的攝取量分別為DOX組的2.06倍和FA+FA-DOX組的1.76倍;FA+FA-DOX組為DOX組的1.19倍。在MTT試驗中FA-DOX各時間點的細(xì)胞IC50(μg.ml-1)分別為:24h:0.99±0.02;48h:0.28±0.07;72h:0.26±0.04。各組對4T1的細(xì)胞生長抑制率依次為:FA-DOXFA+FA-DOXDOX。9)在荷瘤鼠體內(nèi)抑瘤試驗中,當(dāng)給藥第27天時,各組的腫瘤體積增長倍數(shù)分別為:生理鹽水為36.16、免疫+FA-DOX+泡囊為8.99、免疫+FA-DOX+對照泡囊為12.75、免疫+FA-DOX+Fu為15.08、免疫+FA-DOX+生理鹽水為18.98、免疫+FA+DOX+泡囊為17.68、免疫+FA+DOX+對照泡囊為22.40和FA-DOX+泡囊為13.04;以生理鹽水組為基準(zhǔn),算得以上其余各組的抑瘤率依次分別為75.15%、64.73%、58.29%、47.48%、48.89%、38.06%和63.93%。HE染色結(jié)果表明:與生理鹽水組對比,各給藥組腫瘤組織出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞損傷及出血,其中損傷程度依次為免疫+FA-DOX+泡囊組免疫+FA-DOX+Fu組免疫+FA-DOX+生理鹽水組≈FA-DOX+泡囊組免疫+FA+DOX+泡囊組生理鹽水組。結(jié)論:制得的泡囊理化性能較好,有利于將藥物傳輸至癌組織釋放并發(fā)揮作用,細(xì)胞試驗、動物試驗均表明療效顯著。合成的免疫原產(chǎn)生了較好的免疫效果,與相應(yīng)分子橋聯(lián)合使用時可生成免疫復(fù)合物大分子,有助于提升機體對腫瘤細(xì)胞的識別能力,聯(lián)合使用化療和免疫治療可改善兩種療法固有的缺陷,獲得了良好的抗腫瘤能力。
【關(guān)鍵詞】：泡囊 5-氟尿嘧啶 抗體 分子橋 阿霉素
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R943
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 引言13-25
• 一化學(xué)治療14-18
• 1 靶向制劑14-16
• 2 非離子表面活性劑泡囊的研究進展16
• 3 化療給藥系統(tǒng)模型藥物的選擇16-18
• 二免疫治療18-25
• 1 抗原-抗體基本概述18-20
• 2 免疫治療的研究現(xiàn)狀20-23
• 3 模型藥物及靶頭分子的選擇23-25
• 第一章 泡囊的制備、表征及其抗腫瘤效果評價25-43
• 材料25-26
• 一、儀器與設(shè)備25
• 二、藥品與試劑25-26
• 三、溶液配制26
• 四、細(xì)胞株與動物26
• 方法與結(jié)果26-41
• 一 普朗尼克F127-膽固醇的制備及鑒別26-29
• 1 普朗尼克F127-膽固醇的制備26-28
• 2 普朗尼克F127-膽固醇的結(jié)構(gòu)表征28-29
• 二 FU泡囊的制備29-33
• 1 氟尿嘧啶含量測定方法的建立29-30
• 2 泡囊的制備及處方的篩選30-32
• 3 泡囊制備工藝的優(yōu)化32-33
• 三 泡囊理化性質(zhì)的表征33-35
• 1 形態(tài)、粒徑及表面電位測定33-34
• 2 表面水化層厚度的測定34-35
• 四 泡囊包封率測定及體外釋放規(guī)律考察35-37
• 1 包封率的測定35
• 2 藥物體外釋放規(guī)律考察35-37
• 五 體外藥效學(xué)試驗37-40
• 1 細(xì)胞毒性試驗37-39
• 2 細(xì)胞攝取試驗39-40
• 六 體內(nèi)抑瘤試驗40-41
• 小結(jié)與討論41-43
• 第二章 免疫治療的基礎(chǔ)研究43-58
• 材料43-45
• 一儀器與設(shè)備43
• 二藥品與試劑43-44
• 三溶液配制44-45
• 四細(xì)胞株與動物45
• 方法與結(jié)果45-56
• 一免疫原的制備及表征45-49
• 1 免疫原的制備45-46
• 2 免疫原的化學(xué)表征46-47
• 3 免疫原的免疫原性考察47-49
• 二分子橋的制備及表征49-56
• 1 分子橋的合成49-50
• 2 分子橋的表征50-51
• 3 分子橋的靶向功能考察51-56
• 小結(jié)與討論56-58
• 第三章 復(fù)合制劑多重靶向治療方法的建立58-67
• 材料58-59
• 一儀器與設(shè)備58
• 二藥品與試劑58
• 三溶液配制58-59
• 四細(xì)胞株與動物59
• 方法與結(jié)果59-65
• 一荷瘤鼠體內(nèi)多抗產(chǎn)生驗證59
• 二治療方案的設(shè)計59-65
• 小結(jié)與討論65-67
• 全文總結(jié)67-70
• 參考文獻(xiàn)70-78
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文與其它78-79
• 致謝79-80

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳永;任林;尹華熙;魏大鵬;王玉珍;楊紅;;肺靶向順鉑隱形泡囊的研制及其體外生物學(xué)性質(zhì)[J];華西藥學(xué)雜志;2009年01期

  本文關(guān)鍵詞：啟動自身免疫的多靶向抗腫瘤復(fù)合制劑研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：367561