發(fā)布時間：2022-08-10 18:32

　　缺血性腦卒中是常見的心腦血管疾病,具有“高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率、高復發(fā)率”的特點。該疾病嚴重威脅人類健康,給家庭和社會造成沉重的負擔。然而,目前可用于臨床的治療藥物卻十分局限。因此尋找抗缺血性腦卒中的神經(jīng)保護劑十分必要。本論文采用細胞表型篩選的方式,從已上市藥物、化學合成小分子以及天然產(chǎn)物中尋找抗腦缺血損傷的新型、高效、機制新穎的活性化合物。本論文的第一部分內(nèi)容是抗真菌藥物環(huán)吡酮胺的抗腦缺血作用發(fā)現(xiàn)、藥效評價及藥理機制研究。首先應用模擬臨床腦缺血再灌注損傷的快速表型篩選模型——氧糖剝奪（oxygen glucose deprivation,OGD）損傷SH-SY5Y細胞模型,對778個已上市藥物進行活性測試,發(fā)現(xiàn)抗真菌藥物環(huán)吡酮胺具有顯著對抗缺血誘發(fā)神經(jīng)細胞損傷的作用。環(huán)吡酮胺是抗真菌藥物,臨床上廣泛用于治療表皮真菌感染,其對抗腦缺血再灌注誘發(fā)的神經(jīng)損傷作用尚未有文獻報道。論文首先證實環(huán)吡酮胺濃度依賴地改善氧糖剝奪以及氧化應激誘發(fā)SH-SY5Y神經(jīng)細胞損傷。在大鼠大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型中,再灌注時靜脈給予環(huán)... 

【文章頁數(shù)】：120 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 腦卒中概況
    1.2 缺血性腦卒中的多環(huán)節(jié)病理機制
    1.3 抗缺血性腦卒中藥物研發(fā)現(xiàn)狀
    1.4 表型篩選在藥物研發(fā)中的優(yōu)勢
    1.5 已上市藥物和結構新穎多樣小分子是藥物研發(fā)的重要來源
    1.6 新技術涌現(xiàn)為高效發(fā)現(xiàn)藥物靶標帶來曙光
第2章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 活性化合物信息
        2.1.2 細胞系
        2.1.3 實驗動物
        2.1.4 主要試劑耗材
        2.1.5 化合物配制
        2.1.6 試劑配制
        2.1.7 主要儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 SH-SY5Y細胞氧糖剝奪(OGD)損傷模型構建
        2.2.2 SH-SY5Y細胞H2O2損傷模型構建
        2.2.3 HT-22細胞谷氨酸損傷模型建立
        2.2.4 細胞內(nèi)LDH釋放量檢測
        2.2.5 細胞內(nèi)ATP(三磷酸腺苷)的檢測
        2.2.6 流式法檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)
        2.2.7 細胞凋亡檢測
        2.2.8 核蛋白提取
        2.2.9 蛋白質(zhì)免疫印跡
        2.2.10 大鼠MCAO模型
        2.2.11 大鼠腦梗死面積測定
        2.2.12 腦組織含水量測定
        2.2.13 神經(jīng)行為學(mNSS)評分
        2.2.14 ELISA檢測炎癥因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)
        2.2.15 組織化學
        2.2.16 免疫熒光染色(NeuN、GFAP、Iba-1、ZO-1和CD31)
        2.2.17 Tunel染色
        2.2.18 Evansblue血腦屏障完整性檢測
        2.2.19 Rotarod轉(zhuǎn)棒測試運動協(xié)調(diào)能力
        2.2.20 抗體芯片檢測
        2.2.21 磷酸化蛋白質(zhì)組學
        2.2.22 Griess法檢測亞硝酸鹽
        2.2.23 細胞周期檢測
        2.2.24 探針靶標垂釣
        2.2.25 統(tǒng)計方法
第3章 實驗結果與討論
    第一部分 環(huán)吡酮胺抗腦缺血損傷藥效和機制研究
        3.1.1 環(huán)吡酮胺抗腦缺血損傷作用發(fā)現(xiàn)和體內(nèi)外藥效評價
            3.1.1.1 采用表型篩選模型發(fā)現(xiàn)新型抗腦缺血活性小分子——老藥環(huán)吡酮胺
            3.1.1.2 環(huán)吡酮胺在細胞氧糖剝奪和氧化應激模型中量效關系
            3.1.1.3 再灌注時單次給予環(huán)吡酮胺降低MCAO術后大鼠腦梗死體積并改善腦水腫
            3.1.1.4 環(huán)吡酮胺改善MCAO術后大鼠神經(jīng)功能
            3.1.1.5 環(huán)吡酮胺減少MCAO術后大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元缺失
            3.1.1.6 連續(xù)給予環(huán)吡酮胺7天改善MCAO術后大鼠運動功能
            3.1.1.7 連續(xù)給予環(huán)吡酮胺對MCAO術后大鼠存活情況的影響
        3.1.2 環(huán)吡酮胺對缺血再灌注誘發(fā)多重病理環(huán)節(jié)的干預作用
            3.1.2.1 環(huán)吡酮胺抑制MCAO誘發(fā)的腦內(nèi)細胞凋亡
            3.1.2.2 環(huán)吡酮胺抑制MCAO誘發(fā)的腦內(nèi)膠質(zhì)細胞激活
            3.1.2.3 環(huán)吡酮胺減少MCAO術后腦內(nèi)炎性細胞因子的表達
            3.1.2.4 環(huán)吡酮胺抑制MCAO術后腦內(nèi)COX-2高表達
            3.1.2.5 環(huán)吡酮胺保護MCAO大鼠血腦屏障的完整性
            3.1.2.6 環(huán)吡酮胺對血管內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白表達的影響
        3.1.3 環(huán)吡酮胺藥理機制研究
            3.1.3.1 環(huán)吡酮胺上調(diào)OGD處理后細胞內(nèi)HIF-1α表達
            3.1.3.2 外源性鐵劑對環(huán)吡酮胺上調(diào)細胞內(nèi)HIF-1α及其保護作用的影響
            3.1.3.3 環(huán)吡酮胺對細胞內(nèi)蛋白磷酸化水平的影響
            3.1.3.4 環(huán)吡酮胺對OGD處理后細胞內(nèi)AKT,GSK-3β,mTOR,以及p70S6K磷酸化水平的影響
            3.1.3.5 磷酸化蛋白質(zhì)組學實驗流程及數(shù)據(jù)整理
            3.1.3.6 差異磷酸化蛋白的GO分析
            3.1.3.7 差異磷酸化蛋白KEGG信號通路富集分析
            3.1.3.8 差異磷酸化蛋白富集在調(diào)控細胞周期信號通路
            3.1.3.9 環(huán)吡酮胺對LPS激活BV-2細胞周期的影響
            3.1.3.10 連接生物素對環(huán)吡酮細胞保護作用的影響
            3.1.3.11 陽性探針和陰性探針分子在細胞OGD模型上的藥效比較
            3.1.3.12 陽性探針分子和陰性探針分子的差異結合蛋白
        3.1.4 討論
        3.1.5 小結
    第二部分 二芳基酰腙類衍生物A11抗腦缺血損傷藥效和機制研究
        3.2.1 A11在腦缺血損傷的體內(nèi)外模型中藥效評價
            3.2.1.1 二芳基酰腙類衍生物抗缺血損傷活性的發(fā)現(xiàn)
            3.2.1.2 A11保護SH-SY5Y細胞免受OGD損傷
            3.2.1.3 A11減少MCAO術后大鼠腦梗死體積并改善神經(jīng)功能
        3.2.2 A11對腦缺血損傷多重病理環(huán)節(jié)的干預作用
            3.2.2.1 A11減輕氧化應激誘導的神經(jīng)細胞死亡
            3.2.2.2 A11抑制OGD誘導的細胞凋亡
            3.2.2.3 A11減輕OGD誘導的線粒體功能障礙
        3.2.3 A11保護作用機制研究
            3.2.3.1 OGD損傷后不同時間點細胞內(nèi)AKT和ERK磷酸化水平變化情況
            3.2.3.2 A11抑制OGD誘導的細胞內(nèi)ERK磷酸化水平的下調(diào)并上調(diào)AKT磷酸化水平
            3.2.3.3 A11通過激活MEK/ERK和PI3K/AKT信號通路發(fā)揮保護作用
        3.2.4 討論
        3.2.5 小結
第4章 結論
    4.1 環(huán)吡酮胺的抗腦缺血藥理藥效
    4.2 二芳基酰腙類衍生物A11抗腦缺血藥理藥效
參考文獻
附錄 縮略詞表
致謝
作者簡歷及攻讀學位期間的學術論文與研究成果



本文編號：3674143