發(fā)布時(shí)間：2022-01-26 13:40

　　目的:開發(fā)一種既能用于親和純化目標(biāo)蛋白,又可介導(dǎo)不能自主進(jìn)入細(xì)胞的藥物蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮活性的雙功能標(biāo)簽。方法:從已有文獻(xiàn)資料中挑選四種富含堿性氨基酸的鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽（calmodulin binding peptide,CBP）,將其與綠色熒光蛋白（EGFP）融合表達(dá),然后采用與鈣調(diào)蛋白（calmodulin,CaM）親和結(jié)合過(guò)程來(lái)篩選與CaM具有最高親和力的CBP;隨后采用熒光顯微鏡檢測(cè)、激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)以及流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)來(lái)分析測(cè)定和比較候選CBP序列將EGFP重組蛋白自主轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞的能力。最后將篩選到的新型CBP雙功能標(biāo)簽與凋亡蛋白融合表達(dá),考察其與CaM親和結(jié)合后純化重組凋亡蛋白的能力,以MTT法分析此重組蛋白進(jìn)入腫瘤細(xì)胞抑制生長(zhǎng)的能力。結(jié)果:通過(guò)CaM-CBP親和層析篩選出與CaM具高有親和力的三種CBP序列;從重組蛋白胞內(nèi)熒光檢測(cè)結(jié)果得知,帶有野生型骨骼肌肌球蛋白輕鏈激酶CBP序列（MLCK）的重組EGFP蛋白具有最佳跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)效率,且顯著高于來(lái)源于艾滋病毒的經(jīng)典穿膜肽TAT的穿膜效率。以此MLCK新型雙功能標(biāo)簽成功地通過(guò)CaM-CBP親和結(jié)合純化得到重組凋亡蛋... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)生物工程雜志. 2020,40(06)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：13 頁(yè)

【部分圖文】：

質(zhì)粒示意圖

理論上，已經(jīng)通過(guò)His標(biāo)簽親和吸附在Ni-NTA瓊脂糖凝膠介質(zhì)上的CaM可與帶有CBP標(biāo)簽的重組蛋白再進(jìn)行親和結(jié)合，而通過(guò)這種“接力”親和結(jié)合層析分離得到的目標(biāo)蛋白(EGFP-CBP)越多，說(shuō)明相應(yīng)的親和標(biāo)簽CBP與CaM親和力越強(qiáng)。我們以SDS-PAGE分析了通過(guò)上述這種“接力”CaM-CBP親和層析純化得到的目的蛋白的數(shù)量。結(jié)果顯示，在過(guò)量吸附的情況下，等量親和凝膠介質(zhì)吸附的EGFP-CaMKI、EGFP-MLCK、EGFP-smMLCK三種重組蛋白的量遠(yuǎn)多于EGFP-L-Selectin蛋白的量(圖2b、c)，其中以EGFP-MLCK蛋白的含量最高，凝膠掃描表明的蛋白純度極高。BCA試劑盒定量檢測(cè)蛋白樣品的濃度，EGFP-CaMKI、EGFP-MLCK、EGFP-smMLCK、EGFP-L-Selectin四種蛋白的濃度依次為:2.52mg/ml、3.63mg/ml、2.28mg/ml、0.44mg/ml，表明四種CBP與CaM親和力由強(qiáng)到弱依次為MLCK、CaMKI、sm MLCK、L-Selectin。此外，研究在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，通過(guò)商業(yè)化CaM親和層析介質(zhì)(GE公司產(chǎn)品)來(lái)驗(yàn)證四種CBP與CaM的親和力大小。商業(yè)化的CaM介質(zhì)是將CaM通過(guò)化學(xué)鍵直接修飾在瓊脂糖介質(zhì)上，帶有CBP標(biāo)簽的重組蛋白可以與固定在瓊脂糖介質(zhì)上的CaM直接進(jìn)行親和結(jié)合，與CaM親和力越高的CBP，純化得到對(duì)應(yīng)的蛋白越多。SDS-PAGE分析洗脫的蛋白樣品，純化得到蛋白量由高到低依次為:EGFP-MLCK、EGFP-CaMKI、EGFP-sm MLCK、EGFP-L-Selectin(圖3)，與CaM-CBP親和層析實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，MLCK、CaMKI、sm MLCK三種CBP與CaM具有較高的親和力，這三種CBP可作為親和標(biāo)簽分離目的蛋白。

此外，研究在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，通過(guò)商業(yè)化CaM親和層析介質(zhì)(GE公司產(chǎn)品)來(lái)驗(yàn)證四種CBP與CaM的親和力大小。商業(yè)化的CaM介質(zhì)是將CaM通過(guò)化學(xué)鍵直接修飾在瓊脂糖介質(zhì)上，帶有CBP標(biāo)簽的重組蛋白可以與固定在瓊脂糖介質(zhì)上的CaM直接進(jìn)行親和結(jié)合，與CaM親和力越高的CBP，純化得到對(duì)應(yīng)的蛋白越多。SDS-PAGE分析洗脫的蛋白樣品，純化得到蛋白量由高到低依次為:EGFP-MLCK、EGFP-CaMKI、EGFP-sm MLCK、EGFP-L-Selectin(圖3)，與CaM-CBP親和層析實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，MLCK、CaMKI、sm MLCK三種CBP與CaM具有較高的親和力，這三種CBP可作為親和標(biāo)簽分離目的蛋白。2.2 CBP親和標(biāo)簽的穿膜效率研究

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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