目的葡萄糖激酶（GK）是治療Ⅱ型糖尿病的重要靶標。旨在通過原核表達獲得人源GK,并建立葡萄糖激酶激動劑（GKAs）分子篩選體系,用于篩選靶向GK的抗Ⅱ型糖尿病先導化合物。方法采用基因重組的方法構(gòu)建GK原核重組表達載體GK-pET28a,將其轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞BL21（DE3）中,采用IPTG誘導重組蛋白的表達,且對誘導條件進行優(yōu)化。使用Ni-NTA對融合蛋白進行分離純化。通過Western-blot鑒定蛋白且通過雙酶偶聯(lián)法對蛋白酶進行活力測試。建立葡萄糖激酶激動劑分子篩選體系,篩選活性化合物,并通過表面等離子共振技術（SPR）和計算機分子模擬技術探究活性化合物與葡萄糖激酶的結(jié)合情況。結(jié)果通過基因重組將葡萄糖激酶與p ET28a原核表達載體構(gòu)建成融合質(zhì)粒,并且確定最佳誘導表達條件為:0.5 mmol·L^-1,37℃,4～5 h。最佳純化條件為:含10 mmol·L^-1咪唑緩沖液洗雜蛋白,含100 mmol·L^-1咪唑緩沖液洗脫目的蛋白。通過WesternBlot鑒定表達的蛋白為目的蛋白,且蛋白酶具有較高的活力。成功建立GKA... 

【文章來源】：中國海洋藥物. 2020,39(05)CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

GK酶活檢測原理

將GK-p ET28a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達菌株BL21(DE3）中，采用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導法誘導蛋白的表達，IPTG是1種極強的誘導劑，可以誘導表達載體中插入序列的蛋白翻譯，且不被細胞代謝而十分穩(wěn)定。本實驗設置不同誘導條件對蛋白的表達進行優(yōu)化（見圖3），確定了最佳誘導條件為：誘導溫度37℃，IPTG濃度為0.5 mmol·L-1，誘導時間為4～5 h。圖3 不同誘導條件蛋白的表達

不同誘導條件蛋白的表達

【參考文獻】：
期刊論文
[1]世界2型糖尿病新治療劑開發(fā)應用最新進展[J]. 景倩,張鈺.  黑龍江醫(yī)藥. 2019(03)
[2]新型降糖藥物葡萄糖激酶激動劑治療2型糖尿病[J]. 王福銀,潘紫曜,李昌祁.  藥品評價. 2016(01)
[3]以葡萄糖激酶為靶點治療2型糖尿病的實驗研究進展[J]. 劉慧麗,席守民.  河南科技大學學報(醫(yī)學版). 2014(04)



本文編號：3441651