背景:表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）在具有活性EGFR突變的晚期非小細(xì)胞肺癌患者中提供顯著的抗腫瘤活性。第三代EGFR-TKI奧希替尼（Osimertinib）是為了克服EGFR-TKI最常見的耐藥機(jī)制T790M位突變而開發(fā)的,臨床反應(yīng)有效率為59%⁷1%。但是隨著時(shí)間的推移,作為第三代EGFR-TKI靶向抗腫瘤藥物奧希替尼（Osimertinib）也不可避免的會(huì)產(chǎn)生耐藥性,并且已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道了一些有關(guān)第三代EGFR-TKI耐藥機(jī)制。盡管如此,目前為止我們對(duì)第三代EGFR-TKI獲得性耐藥機(jī)制并不完全了解,所以,高效快速的篩選出奧西替尼的潛在耐藥基因,將會(huì)為第三代EGFR-TKI獲得性耐藥機(jī)制的進(jìn)一步探明,新的靶向性藥物的設(shè)計(jì)或是臨床上聯(lián)合使用靶向性藥物治療提供理論依據(jù)。目的:在非小細(xì)胞肺癌腺癌細(xì)胞NCI-H1975中篩選出奧希替尼的潛在耐藥基因,并對(duì)篩選出的基因做進(jìn)一步功能和機(jī)制的研究,為第三代EGFR-TKI獲得性耐藥機(jī)制... 

【文章來源】：河南科技大學(xué)河南省

【文章頁(yè)數(shù)】：72 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 非小細(xì)胞肺癌中耐藥基因篩選的研究進(jìn)展
    1.1 非小細(xì)胞肺癌概述
        1.1.1 非小細(xì)胞肺癌的流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果
        1.1.2 肺腺癌的驅(qū)動(dòng)基因
        1.1.3 EGFR-TKI的耐藥性研究進(jìn)展
    1.2 耐藥基因的篩選
        1.2.1 CRISPR/Cas9 技術(shù)簡(jiǎn)介
        1.2.2 CRISPR/Cas9 高通量篩選流程
        1.2.3 CRISPR/Cas9 高通量篩選的研究進(jìn)展
    1.3 篩選耐藥基因的目的和意義
第2章 CRISPR/Cas9 全基因組文庫(kù)的擴(kuò)增及慢病毒包裝
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞
        2.1.2 主要試劑與材料
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 試劑配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 GeCKOv2 libraries質(zhì)粒的擴(kuò)增
        2.2.2 GeCKOv2 libraries慢病毒的包裝
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 GeCKOv2 libraries文庫(kù)質(zhì)粒的擴(kuò)增結(jié)果
        2.3.2 病毒滴度的測(cè)試結(jié)果
    2.4 實(shí)驗(yàn)討論
第3章 Genome-scale CRISPR文庫(kù)篩選奧西替尼耐藥基因
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 細(xì)胞及質(zhì)粒
        3.1.2 主要試劑與材料
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 試劑配制
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 CCK-8 法測(cè)定奧西替尼的篩選濃度
        3.2.2 奧西替尼對(duì)潛在耐藥基因的篩選(圖3-1)
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 奧西替尼的篩選濃度
        3.3.2 目的細(xì)胞的感染
        3.3.3 高通量測(cè)序的結(jié)果分析
    3.4 實(shí)驗(yàn)討論
第4章 候選耐藥基因FDX1 的功能鑒定
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 細(xì)胞及質(zhì)粒
        4.1.2 主要試劑與材料
        4.1.3 主要儀器
        4.1.4 試劑配制
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 克隆形成試驗(yàn)
        4.2.2 利用CRISPRlentiV2 構(gòu)建目的質(zhì)粒
        4.2.3 慢病毒包裝與感染
        4.2.4 細(xì)胞的基因組提取及T載體連接
        4.2.5 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞存活
        4.2.6 Western Blot蛋白檢測(cè)
        4.2.7 統(tǒng)計(jì)分析
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 建立敲除FDX1 表達(dá)的NCI-H1975 穩(wěn)定細(xì)胞系
        4.3.2 敲除FDX1的H1975 細(xì)胞系c-PARP表達(dá)水平
        4.3.3 敲除FDX1的H1975 細(xì)胞系中EGFR及下游信號(hào)通路的抑制作用
        4.3.4 敲除FDX1對(duì)H1975 細(xì)胞克隆形成和細(xì)胞增殖的影響
    4.4 實(shí)驗(yàn)討論
第5章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
縮略語(yǔ)詞匯表
附錄Ⅰ 質(zhì)粒圖譜
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的基因組定點(diǎn)修飾新技術(shù)[J]. 王夢(mèng)瑤,楊亦農(nóng),邊紅武.  中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào). 2014(05)
[2]Growth factor receptors and related signalling pathways as targets for novel treatment strategies of hepatocellular cancer[J]. Michael Hpfner,Detlef Schuppan,Hans Scherübl.  World Journal of Gastroenterology. 2008(01)



本文編號(hào)：3437261