背景:表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）在具有活性EGFR突變的晚期非小細胞肺癌患者中提供顯著的抗腫瘤活性。第三代EGFR-TKI奧希替尼（Osimertinib）是為了克服EGFR-TKI最常見的耐藥機制T790M位突變而開發(fā)的,臨床反應有效率為59%⁷1%。但是隨著時間的推移,作為第三代EGFR-TKI靶向抗腫瘤藥物奧希替尼（Osimertinib）也不可避免的會產(chǎn)生耐藥性,并且已經(jīng)有文獻報道了一些有關(guān)第三代EGFR-TKI耐藥機制。盡管如此,目前為止我們對第三代EGFR-TKI獲得性耐藥機制并不完全了解,所以,高效快速的篩選出奧西替尼的潛在耐藥基因,將會為第三代EGFR-TKI獲得性耐藥機制的進一步探明,新的靶向性藥物的設(shè)計或是臨床上聯(lián)合使用靶向性藥物治療提供理論依據(jù)。目的:在非小細胞肺癌腺癌細胞NCI-H1975中篩選出奧希替尼的潛在耐藥基因,并對篩選出的基因做進一步功能和機制的研究,為第三代EGFR-TKI獲得性耐藥機制... 

【文章來源】：河南科技大學河南省

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 非小細胞肺癌中耐藥基因篩選的研究進展
    1.1 非小細胞肺癌概述
        1.1.1 非小細胞肺癌的流行病學統(tǒng)計結(jié)果
        1.1.2 肺腺癌的驅(qū)動基因
        1.1.3 EGFR-TKI的耐藥性研究進展
    1.2 耐藥基因的篩選
        1.2.1 CRISPR/Cas9 技術(shù)簡介
        1.2.2 CRISPR/Cas9 高通量篩選流程
        1.2.3 CRISPR/Cas9 高通量篩選的研究進展
    1.3 篩選耐藥基因的目的和意義
第2章 CRISPR/Cas9 全基因組文庫的擴增及慢病毒包裝
    2.1 實驗材料
        2.1.1 質(zhì)粒、菌株及細胞
        2.1.2 主要試劑與材料
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 試劑配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 GeCKOv2 libraries質(zhì)粒的擴增
        2.2.2 GeCKOv2 libraries慢病毒的包裝
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 GeCKOv2 libraries文庫質(zhì)粒的擴增結(jié)果
        2.3.2 病毒滴度的測試結(jié)果
    2.4 實驗討論
第3章 Genome-scale CRISPR文庫篩選奧西替尼耐藥基因
    3.1 實驗材料
        3.1.1 細胞及質(zhì)粒
        3.1.2 主要試劑與材料
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 試劑配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 CCK-8 法測定奧西替尼的篩選濃度
        3.2.2 奧西替尼對潛在耐藥基因的篩選(圖3-1)
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 奧西替尼的篩選濃度
        3.3.2 目的細胞的感染
        3.3.3 高通量測序的結(jié)果分析
    3.4 實驗討論
第4章 候選耐藥基因FDX1 的功能鑒定
    4.1 實驗材料
        4.1.1 細胞及質(zhì)粒
        4.1.2 主要試劑與材料
        4.1.3 主要儀器
        4.1.4 試劑配制
    4.2 實驗方法
        4.2.1 克隆形成試驗
        4.2.2 利用CRISPRlentiV2 構(gòu)建目的質(zhì)粒
        4.2.3 慢病毒包裝與感染
        4.2.4 細胞的基因組提取及T載體連接
        4.2.5 CCK-8 法檢測細胞存活
        4.2.6 Western Blot蛋白檢測
        4.2.7 統(tǒng)計分析
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 建立敲除FDX1 表達的NCI-H1975 穩(wěn)定細胞系
        4.3.2 敲除FDX1的H1975 細胞系c-PARP表達水平
        4.3.3 敲除FDX1的H1975 細胞系中EGFR及下游信號通路的抑制作用
        4.3.4 敲除FDX1對H1975 細胞克隆形成和細胞增殖的影響
    4.4 實驗討論
第5章 結(jié)論
參考文獻
縮略語詞匯表
附錄Ⅰ 質(zhì)粒圖譜
致謝
攻讀碩士學位期間的研究成果


【參考文獻】：
期刊論文
[1]基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的基因組定點修飾新技術(shù)[J]. 王夢瑤,楊亦農(nóng),邊紅武.  中國生物化學與分子生物學報. 2014(05)
[2]Growth factor receptors and related signalling pathways as targets for novel treatment strategies of hepatocellular cancer[J]. Michael Hpfner,Detlef Schuppan,Hans Scherübl.  World Journal of Gastroenterology. 2008(01)



本文編號：3437261