本文關鍵詞：PiggyBac介導多藥物代謝酶穩(wěn)定表達肝細胞系的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：藥物安全性評價是新藥開發(fā)的重要內(nèi)容。而肝臟作為藥物代謝和毒性反應的靶器官在藥物安全性評價中起著至關重要的作用。原代肝細胞作為一種金標準廣泛用于藥物評價,然而受到倫理道德、供體遺傳背景差異、來源有限及體外培養(yǎng)不穩(wěn)定等影響極大地限制了其應用,因此越來越多的研究集中于體外肝細胞模型。Hep G2細胞來源于肝臟,仍然保留了肝臟細胞許多功能性特征且可在體外穩(wěn)定傳代培養(yǎng),是體外肝毒性評價常用的細胞模型。但是與原代肝細胞相比,Hep G2細胞藥物代謝酶表達水平不高嚴重影響該模型進一步應用于藥物代謝和毒性評價。本研究采用高效轉(zhuǎn)座子基因轉(zhuǎn)移技術和細胞單克隆培養(yǎng)技術相結(jié)合,制備藥物代謝酶CYP3A4和CYP2C19同時穩(wěn)定表達轉(zhuǎn)基因Hep G2細胞系。研究首先構(gòu)建CYP3A4和CYP2C19兩基因共表達的重組轉(zhuǎn)座子并將其轉(zhuǎn)染Hep G2細胞,經(jīng)流式細胞分選和細胞有限稀釋,采用細胞克隆環(huán)技術獲得21株嘌呤霉素抗性單克隆細胞�？剐钥寺U大培養(yǎng),經(jīng)倒置相差熒光顯微鏡觀察,挑選3株狀態(tài)良好的抗性單克隆細胞進行鑒定分析。分別應用實時熒光定量PCR、免疫印跡法以及LC-MS/MS檢測細胞CYP3A4及CYP2C19的m RNA,蛋白水平和酶活性水平。實驗結(jié)果顯示:篩選的3株抗性單克隆細胞的藥物代謝酶基因CYP3A4和CYP2C19的m RNA相對表達量顯著高于與未轉(zhuǎn)染細胞;經(jīng)Western Blot檢測分析,抗性單克隆細胞均能成功表達相對分子量約48k Da和56k Da藥物代謝酶CYP3A4和CYP2C19;在酶活性水平檢測中,將抗性單克隆細胞與藥物代謝酶CYP3A4和CYP2C19的底物作用,生成的6β-Hydroxytestosterone和4-Hydroxymephenytoin產(chǎn)生速率顯著高于未轉(zhuǎn)染細胞,表明轉(zhuǎn)基因細胞系具有活性。最終獲得藥物代謝酶CYP3A4和CYP2C19穩(wěn)定表達Hep G2細胞系。
【關鍵詞】：PiggyBac HepG2 藥物代謝 毒理
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第一章 緒論10-20
• 1.1 藥物體外肝代謝模型研究現(xiàn)狀10-12
• 1.2 轉(zhuǎn)座子概述12-15
• 1.2.1 轉(zhuǎn)座子的分類12-13
• 1.2.2 piggyBac轉(zhuǎn)座子與及作用機制13-15
• 1.3 多基因共表達的研究進展15-18
• 1.3.1 多基因共表達的研究現(xiàn)狀15-16
• 1.3.2 2A基因的作用機理和研究現(xiàn)狀16-18
• 1.4 本課題研究思路18-20
• 第二章 重組轉(zhuǎn)座子PB-CYP3A4-P2A-CYP2C19 的構(gòu)建20-31
• 2.1 實驗材料20-21
• 2.1.1 主要儀器和設備20
• 2.1.2 菌株及質(zhì)粒20
• 2.1.3 主要實驗試劑20-21
• 2.1.4 實驗相關試劑和培養(yǎng)基配制21
• 2.2 實驗方法21-26
• 2.2.1 CYP3A4 和CYP2C19 基因的克隆22-25
• 2.2.2 構(gòu)建PB-CYP3A4-P2A-CYP2C19 重組轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒25-26
• 2.3 實驗結(jié)果26-29
• 2.3.1 CYP3A4 和CYP2C19 基因的克隆26-27
• 2.3.2 重組質(zhì)粒pMD-18T-CYP3A4-P2A-CYP2C19 雙酶切鑒定27-28
• 2.3.3 重組質(zhì)粒PB-CYP3A4-P2A-CYP2C19 雙酶切鑒定28-29
• 2.4 討論與小結(jié)29-31
• 第三章 轉(zhuǎn)座子介導HepG2 單克隆細胞系的建立31-44
• 3.1 實驗儀器與材料31-32
• 3.1.1 主要儀器設備31
• 3.1.2 實驗材料31
• 3.1.3 實驗相關試劑配制31-32
• 3.2 實驗方法32-36
• 3.2.1 無內(nèi)毒素質(zhì)粒的制備32
• 3.2.2 篩選大片段質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染HepG2 細胞最佳方法32-35
• 3.2.3 Puromycin對HepG2 細胞毒性試驗35
• 3.2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2 細胞35-36
• 3.2.5 抗性細胞克隆的獲得36
• 3.3 實驗結(jié)果36-42
• 3.3.1 無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA純化試劑盒提取質(zhì)粒和純度測定36-37
• 3.3.2 Puromycin對HepG2 細胞毒性試驗結(jié)果37
• 3.3.3 三種轉(zhuǎn)染方法對HepG2 細胞轉(zhuǎn)染效率比較37-41
• 3.3.4 細胞單克隆化41-42
• 3.4 討論與小結(jié)42-44
• 第四章 穩(wěn)定表達人藥物代謝酶HepG2 細胞系的鑒定及酶活性分析44-58
• 4.1 實驗儀器與材料44-46
• 4.1.1 實驗主要儀器44
• 4.1.2 實驗材料44-45
• 4.1.3 實驗試劑配制45-46
• 4.2 實驗方法46-53
• 4.2.1 抗性細胞克隆轉(zhuǎn)錄水平鑒定46-49
• 4.2.2 Western Blot檢測藥物代謝酶基因CYP3A4 和CYP2C19 基因表達49-50
• 4.2.3 LC-MS/MS測定單克隆細胞對睪酮和美分妥因代謝能力50-53
• 4.3 實驗結(jié)果53-57
• 4.3.1 細胞總RNA電泳檢測53
• 4.3.2 CYP3A4,CYP2C19 基因mRNA水平Real-Time PCR檢測結(jié)果53-54
• 4.3.3 BCA法測細胞中蛋白濃度54
• 4.3.4 Western blot結(jié)果54-55
• 4.3.5 CYP3A4 和CYP2C19 表達蛋白活性測定55-57
• 4.4 討論與小結(jié)57-58
• 結(jié)論與展望58-61
• 參考文獻61-67
• 附錄 CYP3A4-P2A-CYP2C19 基因測序結(jié)果比對67-73
• 攻讀博士/碩士學位期間取得的研究成果73-74
• 致謝74-75
• 附件75

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 馬艷平;劉永生;張杰;丁耀忠;楊生海;;轉(zhuǎn)座子應用的研究進展[J];江西農(nóng)業(yè)學報;2009年05期

2 吳曉暉;;哺乳動物PB轉(zhuǎn)座因子研究[J];生命科學;2007年02期

3 張歡;黃思超;蔡紹暉;;基于2A肽策略構(gòu)建多基因表達載體的研究進展[J];中國生物工程雜志;2013年01期

4 黃春;張萬江;;轉(zhuǎn)座子及其相關技術的研究[J];世界華人消化雜志;2006年17期

5 李丹;韓永龍;余濤;孟祥樂;余奇;王軍;郭澄;;體外肝代謝模型的優(yōu)缺點及其應用[J];中國臨床藥理學與治療學;2011年06期

6 郭峰,劉彥信,鄭德先,蔣澄宇;維甲酸受體為靶點的高通量藥物篩選細胞模型的建立[J];藥學學報;2005年10期

7 邵喜英;陳占紅;曹江;方永明;王曉稼;;pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP真核表達質(zhì)粒構(gòu)建[J];浙江大學學報(醫(yī)學版);2011年02期

8 譚曉秋;陳桂蘭;李濤;毛亮;井上勛;楊艷;曾曉榮;;重疊PCR法構(gòu)建人心房肌SK2(KCNN2)基因表達質(zhì)粒及鑒定和序列分析[J];中國應用生理學雜志;2012年04期

9 雷建平;吳雪瓊;張文宏;;抗結(jié)核藥物所致肝損傷相關危險因素及臨床處置對策[J];中國防癆雜志;2013年11期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 丁f;piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)[D];復旦大學;2007年

  本文關鍵詞：PiggyBac介導多藥物代謝酶穩(wěn)定表達肝細胞系的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號：332938