本文關(guān)鍵詞：PiggyBac介導(dǎo)多藥物代謝酶穩(wěn)定表達(dá)肝細(xì)胞系的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：藥物安全性評(píng)價(jià)是新藥開發(fā)的重要內(nèi)容。而肝臟作為藥物代謝和毒性反應(yīng)的靶器官在藥物安全性評(píng)價(jià)中起著至關(guān)重要的作用。原代肝細(xì)胞作為一種金標(biāo)準(zhǔn)廣泛用于藥物評(píng)價(jià),然而受到倫理道德、供體遺傳背景差異、來源有限及體外培養(yǎng)不穩(wěn)定等影響極大地限制了其應(yīng)用,因此越來越多的研究集中于體外肝細(xì)胞模型。Hep G2細(xì)胞來源于肝臟,仍然保留了肝臟細(xì)胞許多功能性特征且可在體外穩(wěn)定傳代培養(yǎng),是體外肝毒性評(píng)價(jià)常用的細(xì)胞模型。但是與原代肝細(xì)胞相比,Hep G2細(xì)胞藥物代謝酶表達(dá)水平不高嚴(yán)重影響該模型進(jìn)一步應(yīng)用于藥物代謝和毒性評(píng)價(jià)。本研究采用高效轉(zhuǎn)座子基因轉(zhuǎn)移技術(shù)和細(xì)胞單克隆培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合,制備藥物代謝酶CYP3A4和CYP2C19同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)基因Hep G2細(xì)胞系。研究首先構(gòu)建CYP3A4和CYP2C19兩基因共表達(dá)的重組轉(zhuǎn)座子并將其轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞,經(jīng)流式細(xì)胞分選和細(xì)胞有限稀釋,采用細(xì)胞克隆環(huán)技術(shù)獲得21株嘌呤霉素抗性單克隆細(xì)胞�？剐钥寺U(kuò)大培養(yǎng),經(jīng)倒置相差熒光顯微鏡觀察,挑選3株?duì)顟B(tài)良好的抗性單克隆細(xì)胞進(jìn)行鑒定分析。分別應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫印跡法以及LC-MS/MS檢測(cè)細(xì)胞CYP3A4及CYP2C19的m RNA,蛋白水平和酶活性水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:篩選的3株抗性單克隆細(xì)胞的藥物代謝酶基因CYP3A4和CYP2C19的m RNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞;經(jīng)Western Blot檢測(cè)分析,抗性單克隆細(xì)胞均能成功表達(dá)相對(duì)分子量約48k Da和56k Da藥物代謝酶CYP3A4和CYP2C19;在酶活性水平檢測(cè)中,將抗性單克隆細(xì)胞與藥物代謝酶CYP3A4和CYP2C19的底物作用,生成的6β-Hydroxytestosterone和4-Hydroxymephenytoin產(chǎn)生速率顯著高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞,表明轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系具有活性。最終獲得藥物代謝酶CYP3A4和CYP2C19穩(wěn)定表達(dá)Hep G2細(xì)胞系。
【關(guān)鍵詞】：PiggyBac HepG2 藥物代謝 毒理
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第一章 緒論10-20
• 1.1 藥物體外肝代謝模型研究現(xiàn)狀10-12
• 1.2 轉(zhuǎn)座子概述12-15
• 1.2.1 轉(zhuǎn)座子的分類12-13
• 1.2.2 piggyBac轉(zhuǎn)座子與及作用機(jī)制13-15
• 1.3 多基因共表達(dá)的研究進(jìn)展15-18
• 1.3.1 多基因共表達(dá)的研究現(xiàn)狀15-16
• 1.3.2 2A基因的作用機(jī)理和研究現(xiàn)狀16-18
• 1.4 本課題研究思路18-20
• 第二章 重組轉(zhuǎn)座子PB-CYP3A4-P2A-CYP2C19 的構(gòu)建20-31
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20-21
• 2.1.1 主要儀器和設(shè)備20
• 2.1.2 菌株及質(zhì)粒20
• 2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑20-21
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑和培養(yǎng)基配制21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-26
• 2.2.1 CYP3A4 和CYP2C19 基因的克隆22-25
• 2.2.2 構(gòu)建PB-CYP3A4-P2A-CYP2C19 重組轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒25-26
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-29
• 2.3.1 CYP3A4 和CYP2C19 基因的克隆26-27
• 2.3.2 重組質(zhì)粒pMD-18T-CYP3A4-P2A-CYP2C19 雙酶切鑒定27-28
• 2.3.3 重組質(zhì)粒PB-CYP3A4-P2A-CYP2C19 雙酶切鑒定28-29
• 2.4 討論與小結(jié)29-31
• 第三章 轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)HepG2 單克隆細(xì)胞系的建立31-44
• 3.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料31-32
• 3.1.1 主要儀器設(shè)備31
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)材料31
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑配制31-32
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法32-36
• 3.2.1 無內(nèi)毒素質(zhì)粒的制備32
• 3.2.2 篩選大片段質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染HepG2 細(xì)胞最佳方法32-35
• 3.2.3 Puromycin對(duì)HepG2 細(xì)胞毒性試驗(yàn)35
• 3.2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2 細(xì)胞35-36
• 3.2.5 抗性細(xì)胞克隆的獲得36
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-42
• 3.3.1 無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA純化試劑盒提取質(zhì)粒和純度測(cè)定36-37
• 3.3.2 Puromycin對(duì)HepG2 細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果37
• 3.3.3 三種轉(zhuǎn)染方法對(duì)HepG2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率比較37-41
• 3.3.4 細(xì)胞單克隆化41-42
• 3.4 討論與小結(jié)42-44
• 第四章 穩(wěn)定表達(dá)人藥物代謝酶HepG2 細(xì)胞系的鑒定及酶活性分析44-58
• 4.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料44-46
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)主要儀器44
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)材料44-45
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑配制45-46
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法46-53
• 4.2.1 抗性細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)錄水平鑒定46-49
• 4.2.2 Western Blot檢測(cè)藥物代謝酶基因CYP3A4 和CYP2C19 基因表達(dá)49-50
• 4.2.3 LC-MS/MS測(cè)定單克隆細(xì)胞對(duì)睪酮和美分妥因代謝能力50-53
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-57
• 4.3.1 細(xì)胞總RNA電泳檢測(cè)53
• 4.3.2 CYP3A4,CYP2C19 基因mRNA水平Real-Time PCR檢測(cè)結(jié)果53-54
• 4.3.3 BCA法測(cè)細(xì)胞中蛋白濃度54
• 4.3.4 Western blot結(jié)果54-55
• 4.3.5 CYP3A4 和CYP2C19 表達(dá)蛋白活性測(cè)定55-57
• 4.4 討論與小結(jié)57-58
• 結(jié)論與展望58-61
• 參考文獻(xiàn)61-67
• 附錄 CYP3A4-P2A-CYP2C19 基因測(cè)序結(jié)果比對(duì)67-73
• 攻讀博士/碩士學(xué)位期間取得的研究成果73-74
• 致謝74-75
• 附件75

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：PiggyBac介導(dǎo)多藥物代謝酶穩(wěn)定表達(dá)肝細(xì)胞系的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：332938