目的構(gòu)建基于鈣激活氯離子通道（CaCC）的瞬時(shí)受體電位香草酸亞型4（TRPV4）調(diào)節(jié)劑的高通量篩選細(xì)胞模型。方法采用RT-PCR檢測(cè)Fischer大鼠甲狀腺濾泡上皮（FRT）細(xì)胞中內(nèi)源性表達(dá)的TRPV4,所得PCR產(chǎn)物切膠回收后測(cè)序;采用Western blotting檢測(cè)FRT細(xì)胞中TRPV4蛋白的表達(dá)情況。應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法構(gòu)建共表達(dá)鈣激活氯離子通道蛋白1（ANO1）和YFP-H148Q/I152L的FRT細(xì)胞模型,倒置熒光顯微鏡下觀察ANO1和YFP-H148Q/I152L在細(xì)胞中的表達(dá)情況,應(yīng)用熒光淬滅動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞模型的有效性。加入TRPV4激活劑和抑制劑,應(yīng)用熒光淬滅動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)模型能否篩選TRPV4調(diào)節(jié)劑;加入TRPV4激活劑,應(yīng)用Fura-2熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞內(nèi)的Ca²⁺濃度;通過(guò)Z’因子評(píng)估細(xì)胞模型是否適用于高通量篩選。結(jié)果 RT-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,FRT細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)TRPV4。倒置熒光顯微鏡下清晰可見(jiàn)ANO1表達(dá)在FRT細(xì)胞膜上,YFP-H148Q/I152L表達(dá)在FRT細(xì)胞質(zhì)中,即成功構(gòu)建了共表達(dá)AN... 

【文章來(lái)源】：解放軍醫(yī)學(xué)雜志. 2020,45(10)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)

【部分圖文】：

基于CaCC靶向TRPV4的細(xì)胞篩選模型構(gòu)建原理

在加入不同濃度的TRPV4激活劑和抑制劑后,熒光信號(hào)呈現(xiàn)不同的變化。激活劑和抑制劑的濃度與熒光Slope值呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行非線性曲線擬合分析,濃度取對(duì)數(shù)作圖,得到濃度效應(yīng)曲線:GSK1016790A、4α-PDD、RN-1747的EC50分別為9.17、50.06、147.50 μmol/L(圖6A),GSK2193874、HC-067047、RN-1734的IC50分別為5.74、10.91、72.49 μmol/L(圖6B)。該結(jié)果表明激活劑和抑制劑對(duì)TRPV4通道的作用具有濃度依賴性,證實(shí)了該模型可用于TRPV4調(diào)節(jié)劑的篩選。圖6 TRPV4激活劑及抑制劑的劑量依賴曲線(n=3)

將TRPV4條帶的切膠回收產(chǎn)物送生工生物工程股份有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在Chromas軟件上進(jìn)行分析,峰圖結(jié)果如圖1C所示,無(wú)重疊峰,其中豎線位置為內(nèi)含子。所測(cè)核苷酸序列采用美國(guó)生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology informatio,NCBI)的序列比對(duì)工具(basic local alignment search tool,BLAST)進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示其與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的TRPV4基因序列相似性為100%,表明所克隆的DNA片段即為目的基因片段,FRT細(xì)胞在mRNA水平上內(nèi)源性表達(dá)TRPV4(圖1D)。2.2 FRT細(xì)胞中TRPV4蛋白的表達(dá)情況

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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