本文關(guān)鍵詞：dsNKG2D-IL-15殼聚糖納米顆粒的制備及其抗腫瘤活性，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：DsNKG2D-IL-15為2個(gè)NKG2D分子的胞外區(qū)和IL-15的融合蛋白,基于NKG2D分子識(shí)別高表達(dá)于大部分腫瘤細(xì)胞表面的MICA等配體分子,并通過(guò)IL-15發(fā)揮激活NK和CD8+T細(xì)胞的功能,前期研究已證實(shí),該融合蛋白具有明顯的抗腫瘤效應(yīng)。殼聚糖納米材料是一種新興的藥物載體,在基因疫苗以及各類抗腫瘤藥物的運(yùn)輸過(guò)程中扮演越來(lái)越重要的角色。殼聚糖具有生物相容性高,毒性較低,且具有生物可降解性等優(yōu)勢(shì),可作為載體來(lái)制備抗腫瘤納米顆粒。本課題擬將前期構(gòu)建的pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-15重組質(zhì)粒、以及自行制備的dsNKG2D-IL-15融合蛋白分別裝載入HTCC(2-羥丙基三甲基氯化銨)殼聚糖納米顆粒中,形成一定大小的納米凝膠顆粒,體內(nèi)外分別評(píng)估其激活淋巴細(xì)胞的效應(yīng)以及抗腫瘤的效果。研究?jī)?nèi)容分為2個(gè)部分：1.裝載pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-15重組基因的納米顆粒的制備及其抗腫瘤活性目的：利用化學(xué)修飾過(guò)的殼聚糖(HTCC)以及前期工作中構(gòu)建好的重組基因(pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-15)來(lái)制備抗腫瘤納米顆粒。檢測(cè)該納米顆粒的理化性質(zhì),并觀察其能否將重組基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞,且在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)NKG2D和IL-15的融合蛋白。體外觀察腫瘤細(xì)胞受該納米基因顆粒轉(zhuǎn)染后,對(duì)NK與CD8+T細(xì)胞活性的影響,并且體內(nèi)觀察該納米基因顆粒拮抗B16BL6-MICA黑色素移植瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的影響。方法：首先將HTCC與重組質(zhì)粒分別按照質(zhì)量比1：2,2：1,1：1混合,震蕩裝載后,離心取上清,用分光光度計(jì)檢測(cè)其中DNA濃度,按照(DNA總量—游離DNA)/DNA總量的公式來(lái)計(jì)算包封率。取制備好的納米顆粒,用適量的超純水或PBS緩沖液稀釋后,檢測(cè)納米顆粒的粒徑大小及其表面電荷。其次使用MTS/PMS試劑盒檢測(cè)納米顆粒對(duì)RAW264.7以及B16BL6等細(xì)胞的毒性大小。然后,將脂質(zhì)體以及單體蛋白作為對(duì)照,使用納米顆粒轉(zhuǎn)染CT-26等細(xì)胞,72h后通過(guò)FCM檢測(cè)NKG2D的表達(dá)；使用檢測(cè)IL-15的ELISA試劑盒,分析受納米基因顆粒轉(zhuǎn)染后,腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-15的濃度。并且將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞與小鼠脾臟細(xì)胞共孵育,次日檢測(cè)其NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞頻率的改變,以及其活化的情況。最后,給C57BL6小鼠背部皮下接種黑色瘤細(xì)胞B16BL6-MICA,成瘤5日后,分別注射PBS,殼聚糖,肌肉注射,瘤內(nèi)注射,持續(xù)三周,每天記錄荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況,以及小鼠的生存狀況。處死小鼠后,通過(guò)FCM檢測(cè)并分析小鼠脾臟NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的頻率以及CD69、NKG2D和CD44的表達(dá)。結(jié)果：該納米材料能夠裝載入pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-15重組基因,并且包封率可達(dá)到92.8+0.37%。該納米基因顆粒在較高濃度時(shí),對(duì)腫瘤細(xì)胞有一定的毒性。該納米顆粒具備轉(zhuǎn)運(yùn)重組基因dsNKG2D-IL-15至細(xì)胞的能力,且FCM以及ELISA檢測(cè)證實(shí),腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染該納米顆粒后,胞漿內(nèi)NKG2D與IL-15均表達(dá)。該納米顆粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,可促進(jìn)NK細(xì)胞表達(dá)CD69,并上調(diào)CD8+T細(xì)胞表面NKG2D和CD44的表達(dá)。另外,荷瘤小鼠經(jīng)該納米基因顆粒處理后,明顯抑制移植瘤的生長(zhǎng)、且延長(zhǎng)小鼠的生存期。結(jié)論：裝載pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-15重組基因的納米顆�？杀患�(xì)胞吞噬并表達(dá)dsNKG2D-IL-15融合蛋白。該納米基因顆粒體內(nèi)使用后,可通過(guò)激活NK和CD8-T細(xì)胞的功能而發(fā)揮抗腫瘤活性。2.裝載dsNKG2D-IL-15重組蛋白的納米顆粒制備及其抗腫瘤活性目的：通過(guò)HTCC修飾的殼聚糖以及前期制備的dsNKG2D-IL-15融合蛋白,制備裝載待重組蛋白的納米顆粒。體外檢測(cè)該納米顆粒的理化性質(zhì)和細(xì)胞毒性,體內(nèi)注射荷瘤小鼠,觀察該納米顆粒的抗腫瘤效果。方法：利用配制好的HTCC殼聚糖,以及課題組前期制備的dsNKG2D-IL-15重組蛋白,制備負(fù)載融合蛋白的抗腫瘤納米顆粒。取裝載混合物上清,使用分光光度計(jì)檢測(cè)游離蛋白濃度,按照下列公式計(jì)算包封率：(總蛋白量-游離蛋白量)／總蛋白量×100%。用動(dòng)態(tài)光散射儀檢測(cè)納米顆粒的粒徑,以及納米顆粒表面的Zeta電位。使用MTS/PMS試劑盒檢測(cè)該納米顆粒對(duì)細(xì)胞的毒性作用,并通過(guò)透析和蛋白凝膠電泳檢測(cè)納米顆粒中蛋白的釋放。最后,給C57BL/6小鼠背部皮下接種B16BL6-MICA黑色素瘤細(xì)胞,成瘤5天后,分別給每組小鼠注射生理鹽水(PBS),殼聚糖(HTCC)溶液,制備好的納米顆粒以及單體重組蛋白。持續(xù)3周,每天記錄小鼠生存狀況,以及腫瘤生長(zhǎng)的情況。處死小鼠后,分析荷瘤小鼠脾臟NK和CD8+T細(xì)胞頻率的改變和活化狀態(tài)。結(jié)果：HTCC殼聚糖溶液可包裹溶液中的dsNKG2D-IL-15重組蛋白,且質(zhì)量比為1：1時(shí)最高,達(dá)到95.3%。粒徑大小在200 nm左右,表面帶5.3 mV正電荷。該納米凝膠對(duì)B16BL6等腫瘤細(xì)胞有一定毒性,而對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7毒性相對(duì)較小。在體外釋放實(shí)驗(yàn)中,能夠在24小時(shí)有效釋放重組蛋白。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,該納米顆粒治療組與PBS以及殼聚糖對(duì)照組相比,在C56BL/6小鼠體內(nèi)能夠有效抑制B16BL6-MICA黑色素移植瘤的生長(zhǎng),并延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期。荷瘤小鼠脾臟中NK以及CD8+T細(xì)胞的頻率增多,其表面NKG2D、CD44的表達(dá)上調(diào)。結(jié)論：裝載dsNKG2D-IL-15重組蛋白的納米顆粒體外有效釋放重組蛋白的能力,體內(nèi)使用具有明顯抑制腫瘤的活性,該活性與促進(jìn)NK以及CD8+T細(xì)胞的活化有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：納米顆粒 抗腫瘤 重組基因 NKG2D IL-15
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R943;R96
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• 英文摘要6-10
• 符號(hào)說(shuō)明10-12
• 引言12-15
• 參考文獻(xiàn)13-15
• 第一部分：裝載重組基因dsNKG2D-IL-15殼聚糖納米顆粒制備及其抗腫瘤活性15-30
• 材料15-16
• 方法16-20
• 結(jié)果20-27
• 討論27-28
• 參考文獻(xiàn)28-30
• 第二部分：裝載重組蛋白dsNKG2D-IL-15殼聚糖納米顆粒制備及其抗腫瘤活性30-40
• 材料30-31
• 方法31-33
• 結(jié)果33-38
• 討論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-40
• 文獻(xiàn)綜述：靶向納米載體的抗腫瘤應(yīng)用研究進(jìn)展40-48
• 參考文獻(xiàn)44-48
• 致謝48-49
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文49-50

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