背景及目的:內(nèi)含肽作為一種可以介導(dǎo)自身從前體蛋白質(zhì)中自我切除,同時(shí)將內(nèi)含肽兩側(cè)的外顯肽蛋白通過肽鍵連接起來(lái)的功能性蛋白質(zhì),在過去的十幾年中迅速地被人們所認(rèn)知和利用。隨著對(duì)內(nèi)含肽剪接機(jī)制研究的逐步深入,人們對(duì)內(nèi)含肽的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。如,內(nèi)含肽在蛋白質(zhì)的純化過程中與標(biāo)簽連用的應(yīng)用,內(nèi)含肽的自我斷裂可以很容易地將標(biāo)簽從純化體系中去除,避免了通過蛋白酶等方法去除標(biāo)簽對(duì)目的蛋白的影響,具有很大的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展前景;在蛋白質(zhì)連接過程中,內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)連接技術(shù)也廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)工程以及雙效特異性抗體的研究中;此外還在基因診斷治療,生物傳感器等方面均有很廣泛的應(yīng)用。早期應(yīng)用的內(nèi)含肽多為連續(xù)型內(nèi)含肽,如Sce VMA,mini-Mtu RecA,Ssp DnaB等。他們?cè)诘鞍踪|(zhì)的純化連接過程中作出很多貢獻(xiàn),但是,連續(xù)型內(nèi)含肽在純化過程中極容易提前自我斷裂,而且反應(yīng)速率較慢,時(shí)間較長(zhǎng)。而后人工斷裂Ssp DnaB被人們發(fā)現(xiàn)和利用,將內(nèi)含肽的兩片段分開表達(dá)大大降低了內(nèi)含肽提前自我斷裂的可能性。Npu DnaE是一種天然的斷裂型的內(nèi)含肽。將內(nèi)含肽的兩片段分別融合純化標(biāo)簽和目的蛋白,在蛋白質(zhì)純化過程中很... 

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內(nèi)含肽的結(jié)構(gòu)模式圖

圖 1-2 內(nèi)含肽四步剪接反應(yīng)機(jī)理Fig.1-2 Mechanism of intein splicing.第一步：內(nèi)含肽與 N 末端外顯肽通過肽鍵相連接，內(nèi)含肽 N 末端的巰基對(duì)這個(gè)肽鍵進(jìn)行親核進(jìn)攻，通過 N-O 或 N-S 基團(tuán)發(fā)生重排，使得肽鍵發(fā)生遷移后形成一個(gè)線性的酯鍵，N 端外顯肽結(jié)合到絲氨酸／蘇氨酸的氧原子或半胱氨酸的硫原子上。第二步：N 末端外顯肽通過酯基遷移作用，從內(nèi)含肽第一個(gè)氨基酸殘基遷移到了 C 末端外顯肽的第一位氨基酸殘基上。第三步：內(nèi)含肽 C 末端保守的天冬氨酸環(huán)化，伴隨著肽鍵的斷裂，使得內(nèi)含肽和外顯肽發(fā)生分離。第四步：巰基再一次對(duì)肽鍵進(jìn)行親核進(jìn)攻，使得兩個(gè)外顯肽經(jīng)過重排的作用

上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文2 mM Zn2+，在 25℃，180rpm 的條件下誘導(dǎo)過夜。離心（5000g，5min）收集菌體后用 ICP 測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鋅離子濃度。2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2.3.1 單獨(dú)表達(dá) pBad-HisA /Fc-NpuN 重組蛋白及鋅離子容忍度對(duì)上述加入了 1mM~2.5mM 鋅離子的大腸桿菌取相同菌體量進(jìn)行 SDS-PAGE 和 Western-Blot 分析，結(jié)果如圖 3.1。kD


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