發(fā)布時間：2021-04-15 19:28

　　[目的】建立并優(yōu)化HIV-1env/HIV-1Aenv假病毒篩選抗HIV-1藥物體系,對初篩活性好的化合物進行體外抗HIV-1活性研究。[方法]采用HIV-1包膜質(zhì)粒pCNE49與HIV-1骨架質(zhì)粒pNL4-3Luc R-E-共同轉(zhuǎn)染293T細胞來獲得HIV-1Luc假病毒,并采用Promega公司的熒光素酶活性分析系統(tǒng),評價在不同濃度的DEAE-葡聚糖溶液的存在下,HIV-1Luc對TZM-bl細胞的感染力。對不同類型HIV-1上市藥物進行抗假病毒活性評價,并與HIV-1mB病毒篩選體系所得結(jié)果進行比較,以驗證該模型的可行性與有效性。進而將假病毒應(yīng)用于化合物的抗HIV-1活性篩選。對活性較好的化合物進行進一步的體外抗HIV-1活性評價,包括采用MTT法檢測化合物對不同細胞株的毒性作用,ELISA檢測p24法、MTT法和熒光素酶分析方法在不同細胞中評價化合物對不同病毒株以及假病毒的抑制活性。[結(jié)果]HlV-1Luc對TZM-bl細胞的感染力隨著DEAE-葡聚糖溶液濃度的升高顯著增加,且熒光素酶報告基因的表達水平與加入的病毒量呈劑量依賴關(guān)系。不同陽性藥物抑制HIV-1Luc的EC50與H... 

【文章來源】：昆明醫(yī)科大學(xué)云南省

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２?ｍｖ－ｉ的復(fù)制周期ｗ??ＨＩＶ－ｌ進入宿主細胞是一個包括病毒吸附、病毒包膜糖蛋白ｇｐｌ２０與細胞??表面ＣＤ４分子結(jié)合、ｌ２０與輔助受體結(jié)合、ｇ４１暴露并介導(dǎo)病毒包膜與細胞??

濃度和比例、細胞密度等各方面條件的影響［５１］，為了獲得具有較高滴度的假病毒，??我們檢測了包膜質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒的比例分別為１：１、１：２、１：３和１：４時轉(zhuǎn)染上清中??的ｐ２４含量。結(jié)果如圖３所示，當(dāng)兩個質(zhì)粒的比例為１：４時轉(zhuǎn)染上清檢測的０Ｄ值最??高，上清中ｐ２４含量最多，轉(zhuǎn)染效率最高。此外，在轉(zhuǎn)染時２９３Ｔ細胞匯合度達９０％??時轉(zhuǎn)染效率較高。因此，后續(xù)實驗我們采用包膜質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒的比例為１：４，??并且當(dāng)細胞匯合度達９０％時進行轉(zhuǎn)染。??１．０－?￣￣??內(nèi)丁??ｒ＋ｉ??Ｑ??０．５－??０．０?？?ｉ?■?Ｉ?■?ｉ?？?Ｉ?■?Ｉ??１：１?１：２?１：３?１：４??ｐＣＮＥ４９：ｐＮＬ４－３?Ｌｕｃ??圖３不同質(zhì)粒比例轉(zhuǎn)染上清的ＯＤ值??１．２?ＨＩＶ－ｌｗ?感染?ＴＺＭ－ｂｌ?細胞??首先，我們采用不同稀釋度的假病毒感染ＴＺＭ－ｂｌ細胞，但是感染后細胞中??熒光素酶活性較低，無法達到用于藥物篩選的目的。因此，為了提高假病毒的感??２８??

?染性，經(jīng)過查閱文獻后，我們采用不同濃度ＤＥＡＥ－葡聚糖溶液來促進病毒吸附。??結(jié)果如圖４所示，ＤＥＡＥ－葡聚糖溶液的加入能夠顯著增加細胞中熒光素酶活性水??平，并且熒光素酶活性水平與ＤＥＡＥ－葡聚糖溶液的濃度呈劑量依賴關(guān)系。ＤＥＡＥ－??葡聚糖是一種陰離子交換劑，能夠促進病毒吸附，為驗證其是否會對細胞活性產(chǎn)??生影響，我們檢測了ＤＥＡＥ＿葡聚糖溶液對ＴＺＭ－ｂｌ細胞的毒性作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)??ＤＥＡＥ－葡聚糖對ＴＺＭ－ｂ】細胞毒性較小，其ＣＣ５０值大于２００ｊｎｇ／ｍｌ。所以之后的研宄，??我們采用ＨＩＶ－ｌｗ感染ＴＺＭ－ｂｌ細胞，同時加入終濃度ｌＯｐｇ／ｍｌ的ＤＥＡＥ－葡聚糖溶??液促進病毒吸附。??Ａ?Ｌｕｄｆｅｒａｓｅ?Ｂ?Ｃｙｔｏｉｏｉｉｃｉｔｊ?ｏｆ?ＤＥＡＥ?ｏｎ?ＴＺＭ－ｂｌ??２４０００?－?■???？?？?ａｌ?１４０?－??—５３?Ｕｆ?ＯＬ????誦－?丄一口＾??ｇ??１Ｃ?ｔＪｊ．ｏＬ??雲(yún)科?ｉ：內(nèi)?ｆ］?ｆｌ?ｆｌ?［１??８０００－?ｍ?＞?ＩＣＣ．．，》２００?叫．‘?｜??測ｗ：：??０?２０?４?０?６０?ＳＱ?１００?１２０?２００?４０?８?１－Ｓ?０３２?０．０６４?－??＊?毒置?Ｏｉｌ？孔）?Ｃｃｏｃｅｎｔｒ？ｊ〇ｎ（ｕｇ／ｍＬ）??圖４?Ａ．?ＨＩＶ－ｌＬｕｔ感染ＴＺＭ－ｂ丨細胞后的熒光素酶活性；Ｂ．?ＤＥＡＥ－葡聚糖對ＴＺＭ－ｂ丨細胞??的毒性作用??１．３陽性藥物對ＨＩＶ－Ｕｕｅ的抑制作用??為了驗證ＨＩＶ－ｋＵ（：能否用于藥物篩選以及ＤＥＡＥ－葡聚糖溶液是否會對藥物??對病毒的抑制作用產(chǎn)生影響

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
[1]艾滋病抑制劑的計算機輔助藥物研究[D]. 吳英紀(jì).陜西科技大學(xué) 2017
[2]HIV-1假病毒篩選藥物體系的建立及DY系列化合物抗HIV-1活性研究[D]. 王萍.昆明醫(yī)科大學(xué) 2016



本文編號：3139953