白介素-2（Interleukin-2,IL-2）是一種具有多功能免疫調節(jié)作用的細胞因子,由于在人體內半衰期短因此在臨床應用時受到限制。本研究室前期工作中,將人血清白蛋白（HSA）與人IL-2（HSA/IL-2）融合并先后在畢赤酵母、CHO細胞兩種表達體系中成功表達。畢赤酵母缺乏完善的翻譯后修飾功能,蛋白糖基化形式不完全,蛋白質存在降解等問題。CHO細胞表達HSA/IL-2時在一定程度上解決了酵母表達體系的問題,且蛋白具有良好的生物活性,提高了HSA/IL-2的成藥性。但CHO細胞培養(yǎng)存在以下問題:（1）實驗室前期使用的無血清培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)基含多種蛋白成分,培養(yǎng)基性質不穩(wěn)定,培養(yǎng)基不易保藏;（2）搖瓶培養(yǎng)規(guī)模小,不能滿足HSA/IL-2的后續(xù)研究及產業(yè)化發(fā)展。本課題將以此為出發(fā)點,篩選并優(yōu)化CHO細胞的培養(yǎng)基體系,并探究CHO細胞在攪拌式生物反應器中的培養(yǎng)工藝。為解決培養(yǎng)基問題,考察了四種商業(yè)化無血清培養(yǎng)基的特性,完成細胞懸浮馴化。結合CHO細胞生長密度和活率,篩選出最優(yōu)基礎培養(yǎng)基M1。通過流加培養(yǎng)方式,篩選出最優(yōu)流加培養(yǎng)基F3。通過添加蛋白水解物（酵母提取物、大豆蛋白水解物、胰蛋白... 

【文章來源】：江南大學江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：43 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 白介素-2 概況
        1.1.1 人白介素-2
        1.1.2 人IL-2 分子結構及其生物活性
        1.1.3 重組人IL-2 藥物現(xiàn)狀
        1.1.4 重組人IL-2 類似物的研究
        1.1.5 融合蛋白HSA/IL-2 的研究
    1.2 中國倉鼠卵巢細胞表達系統(tǒng)概況
        1.2.1 常用表達系統(tǒng)
        1.2.2 CHO細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點
        1.2.3 CHO細胞生長方式
    1.3 哺乳動物細胞培養(yǎng)工藝研究
        1.3.1 細胞培養(yǎng)模式
        1.3.2 動物細胞生物反應器
        1.3.3 CHO細胞培養(yǎng)過程中參數(shù)檢測及控制
    1.4 立題意義和研究內容
第二章 實驗材料和方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 細胞株
        2.1.2 實驗試劑
        2.1.3 儀器設備
        2.1.4 培養(yǎng)基及溶液配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 CHO細胞的培養(yǎng)與凍存
        2.2.2 CHO細胞的懸浮馴化
        2.2.3 蛋白檢測方法
        2.2.4 基礎培養(yǎng)基及流加培養(yǎng)基篩選實驗
        2.2.5 添加小分子促進劑的流加培養(yǎng)
        2.2.6 CHO細胞周期及細胞凋亡測定
        2.2.7 CHO細胞培養(yǎng)過程中生化指標測定
        2.2.8 攪拌式生物反應器中CHO細胞培養(yǎng)工藝流程
        2.2.9 Western blot檢測
        2.2.10 融合蛋白生物活性檢測
        2.2.11 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析
第三章 結果與討論
    3.1 CHO細胞無血清懸浮培養(yǎng)特性
        3.1.1 CHO細胞懸浮馴化培養(yǎng)
        3.1.2 無血清培養(yǎng)基篩選
        3.1.3 流加培養(yǎng)過程中CHO細胞生長、代謝及融合蛋白表達情況
    3.2 提高CHO細胞密度及延長細胞培養(yǎng)周期的培養(yǎng)基優(yōu)化
        3.2.1 小分子添加劑對CHO細胞生長及目的蛋白表達量的影響
        3.2.2 水解物添加濃度的確定
        3.2.3 流加培養(yǎng)過程中水解物對CHO細胞生長及目的蛋白表達的影響
        3.2.4 酵母提取物YE對培養(yǎng)基滲透壓影響
        3.2.5 酵母提取物YE對CHO細胞周期的影響
        3.2.6 酵母提取物YE對CHO細胞凋亡的影響
    3.3 攪拌式生物反應器中CHO細胞培養(yǎng)工藝研究
        3.3.1 消泡劑添加濃度篩選
        3.3.2 通氣量和攪拌速率對CHO細胞生長的影響
        3.3.3 攪拌式生物反應器流加培養(yǎng)過程中CHO細胞生長及代謝
        3.3.4 生物反應器流加培養(yǎng)過程的優(yōu)化
        3.3.5 融合蛋白驗證
主要結論與展望
    主要結論
    展望
致謝
參考文獻
附錄: 作者在攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文


【參考文獻】：
期刊論文
[1]重組CHO細胞無血清培養(yǎng)基的研制[J]. 趙麗麗,劉忠,程凡亮,吳洪英.  中國生物制品學雜志. 2014(07)
[2]人血清白蛋白-血管鈉肽融合蛋白在畢赤酵母中的表達[J]. 崔燕生,姜曰水,高昊,雷楗勇,錢凱,陳蘊,段作營,金堅.  工業(yè)微生物. 2014(03)
[3]pPIC9K-IL-2重組質粒的構建及其在畢赤酵母中的表達[J]. 劉斌,祁光宇,陳曉宇,王宇,牟克斌,黃銀君,劉學榮.  甘肅農業(yè)大學學報. 2014(03)
[4]人血清白蛋白融合技術研究進展[J]. 鄭煒,李杰.  長沙大學學報. 2013(05)
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[6]哺乳動物細胞高效表達系統(tǒng)研究進展[J]. 柏家林.  西北民族大學學報(自然科學版). 2013(01)
[7]人白介素2-人血清白蛋白融合蛋白的純化及活性鑒定[J]. 李波,段作營,張紅梅,雷楗勇,陳蘊,唐瑜菁,金堅,李華鐘.  食品與生物技術學報. 2012(03)
[8]白介素-2治療腎癌的護理體會[J]. 李艷,張自茹.  實用臨床醫(yī)藥雜志. 2011(02)
[9]重組融合人血清白蛋白-人白介素-2 C125A突變體在畢赤酵母中的表達[J]. 金光澤,段作營,張蓮芬,金堅,李華鐘.  食品與生物技術學報. 2010(04)
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博士論文
[1]GS-CHO細胞無血清培養(yǎng)過程的開發(fā)與優(yōu)化[D]. 范里.華東理工大學 2010

碩士論文
[1]人白介素-2和人血清白蛋白融合蛋白在中國倉鼠卵巢細胞中的表達[D]. 盧慧惠.江南大學 2015
[2]重組人促紅素（CHO-rhEPO）細胞的大規(guī)模擴增培養(yǎng)研究[D]. 董學平.齊魯工業(yè)大學 2012
[3]GS-CHO細胞培養(yǎng)工藝優(yōu)化[D]. 劉美.東北農業(yè)大學 2012
[4]rIL2-HSA融合蛋白注射劑型的開發(fā)研究[D]. 羅文.江南大學 2012



本文編號：3046134