目的:利用基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜成像技術(shù)建立食品及中藥材樣品組織中生物堿的可視化分布。（1）研究不同貯藏時間下,四種有毒糖苷生物堿在馬鈴薯塊莖中的三個不同組織部位（芽、周皮和髓質(zhì)）的成像分布及變化規(guī)律;（2）探討了一種基于砂紙的簡單、快速的新型樣品制備方法,并在中藥貝母的生物堿成像分布中得到了具體應(yīng)用。研究方法:（1）市售馬鈴薯塊莖樣品在室溫條件下,分別貯藏0,10,15,20,30,40,60天。分別取樣后,樣品經(jīng)液氮快速冷凍,并在–18 ^oC的冷凍切片機(jī)內(nèi)進(jìn)行組織切片,隨后將薄片迅速轉(zhuǎn)移到涂有氧化銦錫層（ITO）的導(dǎo)電載玻片上。隨后將其置于成像質(zhì)譜顯微鏡（iMScope）儀器上采集光學(xué)圖像。采用2,5-二羥基苯甲酸（DHB）作為基質(zhì)及“兩步結(jié)合法”的基質(zhì)噴涂方法來檢測馬鈴薯塊莖中的糖苷生物堿。在正離子模式下對組織切片進(jìn)行一級和二級質(zhì)譜電離。采用Logistic方程中的Growth/sigmoidal模型對馬鈴薯塊莖中的糖苷生物堿生長趨勢進(jìn)行了擬合和預(yù)測;（2）中藥貝母在–20 ^oC的冷凍切片機(jī)內(nèi)進(jìn)行組織切片,利用導(dǎo)電雙面膠輔助轉(zhuǎn)移薄片至... 

【文章來源】：中國醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

典型的甾體生物堿結(jié)構(gòu)示意圖

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3[25]。飛行時間檢測器（TOF）是MALDI最常聯(lián)用的質(zhì)譜分析儀，其具有速度快、靈敏度高和質(zhì)量范圍寬（m/z,1-100000）等獨特的優(yōu)勢�；|(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜成像（Matrixassistedlaserdesorption/ionizationmassspectrometryimaging,MALDI-MSI）技術(shù)是一項引人注目的新技術(shù)，最早由Caprioli等人[26]提出。該技術(shù)具有無標(biāo)記、高靈敏度、高通量、分子特異性強(qiáng)、能一次從組織樣本中同時定位多種生物分子等特點，廣泛應(yīng)用到臨床、藥學(xué)、環(huán)境、食品等各個領(lǐng)域[27-29]。MALDI-MSI的具體過程如下，首先對樣品組織進(jìn)行切片并使其粘貼在導(dǎo)電載破片上，隨后將基質(zhì)通過各種沉積方法（升華法、噴霧法、重結(jié)晶法等）均勻的噴涂于樣品組織表面[30]。待測物分子被均勻擴(kuò)散到有機(jī)基質(zhì)分子中，并形成共結(jié)晶。隨后使用激光照射形成的共結(jié)晶，基質(zhì)分子吸收激光能量，導(dǎo)致結(jié)晶升華，從而使樣品中的待測物分子從共結(jié)晶表面解吸，基質(zhì)和待測物發(fā)生膨脹，進(jìn)行氣相質(zhì)子交換，實現(xiàn)待測物離子化，離子化分子在電場或負(fù)壓作用下進(jìn)入質(zhì)譜部分。最后利用特定的質(zhì)譜成像軟件重構(gòu)樣品組織的質(zhì)譜信息，即將質(zhì)譜儀所獲得的樣品上每個點的質(zhì)譜信息轉(zhuǎn)化為樣品組織上的像素點，完成對組織樣品的可視化分子成像。典型的MALDI-MSI流程如圖2所示。圖2典型的MALDI-MSI技術(shù)的工作流程圖近年來，隨著MALDI新基質(zhì)的開發(fā)和離子化技術(shù)的改進(jìn)，MALDI-MSI逐漸

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文12為了進(jìn)一步比較這些基質(zhì)在MALDI-MSI分析中的沉積和電離能力，我們還在馬鈴薯塊莖的空白組織切片上比較了不同基質(zhì)對α-茄堿的靈敏度和選擇性。基質(zhì)溶液（20mg/mL）和α-茄堿（1mg/mL）以1:1的比例混合。然后將該混合物溶液滴加到噴槍的空腔中，并連續(xù)噴灑在粘貼有20μm馬鈴薯塊莖切片的導(dǎo)電玻璃片上，間隔30s循環(huán)10次。待有機(jī)溶劑蒸發(fā)后，將導(dǎo)電載玻片安裝在質(zhì)譜顯微鏡內(nèi)，借助放大20倍的CCD攝像機(jī)確定成像區(qū)域。如圖4e,f,g,h所示，DHB、CHCA噴涂的組織切片可以明顯觀察到α-茄堿的相關(guān)離子（[M+H]+,m/z868.5）信號，而2,4,6-THAP和SA基質(zhì)處理的切片α-茄堿信號響應(yīng)較弱，甚至無α-茄堿信號。這一結(jié)果表明，采用MALDI-MSI檢測馬鈴薯塊莖中的GAs時，DHB和CHCA基質(zhì)對GAs具有較高的選擇性。值得注意的是，DHB噴涂的組織切片，α-茄堿離子強(qiáng)度遠(yuǎn)高于CHCA處理的切片。此外，CHCA晶體具有非均勻分布的特點，分析物未被基質(zhì)完美包裹，對目標(biāo)物成像不利。根據(jù)以上實驗結(jié)果，我們最終選擇DHB作為GAs檢測的基質(zhì)。圖3MALDI-TOF-MSI檢測不同基質(zhì)下α-茄堿的離子峰（α-茄堿濃度：1mg/mL，每種基質(zhì)濃度：20mg/mL）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]質(zhì)譜成像技術(shù)在食品科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 唐雪妹,謝書越,黃玉芬,萬凱,王富華.  食品科學(xué). 2019(13)
[2]甾體生物堿定量分析方法的研究進(jìn)展[J]. 楊炳友,許振鵬,劉艷,匡海學(xué).  中國實驗方劑學(xué)雜志. 2018(16)
[3]基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜成像技術(shù)及其在食品分析中的應(yīng)用[J]. 殷小鈺,陳倩,韓齊,孔保華.  食品科學(xué). 2018(07)
[4]酸性染料比色法測定浙貝母中總生物堿的含量[J]. 丁霞,李幼榮,房克慧.  中國藥業(yè). 1999(10)

碩士論文
[1]貝母生物堿組分的制備與質(zhì)量評價方法建立[D]. 劉建梅.華東理工大學(xué) 2014
[2]川貝母生物堿成分與品質(zhì)研究[D]. 王曉靜.四川大學(xué) 2004



本文編號：3017890