Beclin 1可以誘導(dǎo)自噬發(fā)生,在腫瘤生長過程中發(fā)揮重要作用。據(jù)報(bào)道:在75%的卵巢癌、40%的前列腺癌和50%的乳腺癌中存在Beclin 1基因的缺失性突變,導(dǎo)致自噬功能降低。因此,若能提高這些腫瘤中Beclin 1的含量,腫瘤細(xì)胞就會因過度自噬而死亡,從而達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。然而,Beclin 1自身不能進(jìn)入細(xì)胞,缺乏組織特異性而且體內(nèi)穩(wěn)定性差,限制了其在腫瘤治療方面的應(yīng)用。本課題根據(jù)腫瘤酸性微環(huán)境和低pH插入肽(pHLIP)在酸性條件下可高效穿過細(xì)胞膜的特性,首次設(shè)計(jì)并原核表達(dá)了Trx-pHLIP-Beclin 1(TpB)融合蛋白,并在細(xì)胞和動物水平對其抗腫瘤活性進(jìn)行了驗(yàn)證。本論文主要有以下三部分研究內(nèi)容:(1)化學(xué)合成pHLIP-Beclin 1基因?qū)⑵溥B接到pET-32a表達(dá)載體上,轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)表達(dá)宿主,通過Ni離子親和層析柱純化獲得目的蛋白TpB。通過SDS-PAGE、質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)及圓二色譜對純化后的蛋白進(jìn)行表征。蛋白純度可達(dá)95%以上、氨基酸序列正確。在弱酸性(pH 6.5)條件下與POPC脂質(zhì)體孵育后,TpB可在193 nm處出現(xiàn)一正峰,在209 nm和222 nm處出現(xiàn)兩個(gè)負(fù)峰。以上結(jié)果表明TpB成功表達(dá),其在弱酸性條件下可形成跨膜α螺旋。(2)選用人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3作為研究對象,通過MTT、結(jié)晶紫染色和CFDA-SE方法檢測TpB對腫瘤細(xì)胞生長和增殖的抑制作用。MTT結(jié)果表明:在pH 6.5條件下,TpB對兩種細(xì)胞的IC_(50)值分別為12.79?M和16.73?M。10?M TpB處理兩種細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)CFDA-SE熒光強(qiáng)度顯著增加,表明TpB顯著抑制了兩種細(xì)胞的增殖。為了驗(yàn)證TpB細(xì)胞毒性的分子機(jī)制是否是自噬性細(xì)胞死亡,我們通過AO染色法、Ad-mCherry-GFP-LC3B慢病毒轉(zhuǎn)染、TEM和Western blot等方法檢測了TpB的自噬誘導(dǎo)活性。結(jié)果表明在pH 6.5條件下,10?M TpB可誘導(dǎo)兩種細(xì)胞發(fā)生大量自噬。因此,TpB對兩種細(xì)胞的毒性可歸結(jié)于其自噬誘導(dǎo)活性。(3)通過皮下注射SKOV 3細(xì)胞建立荷瘤裸鼠模型,將荷瘤裸鼠分為四組:生理鹽水、Trx、Beclin 1和TpB組,每兩天尾靜脈注射給藥一次,測量腫瘤體積。結(jié)果表明,TpB明顯抑制了腫瘤的快速生長,而Trx和Beclin 1處理組對腫瘤生長沒有抑制作用。為了揭示TpB抑制腫瘤生長的分子機(jī)制,對各處理組的腫瘤組織進(jìn)行了HE染色、免疫組織化學(xué)染色和Western blot分析。TpB處理組細(xì)胞數(shù)量明顯減少并且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了顯著變化,細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki-67表達(dá)下調(diào),而自噬標(biāo)志物L(fēng)C3水平升高、p62水平降低,表明TpB通過激活自噬過程來抑制腫瘤生長。為了檢測TpB的體內(nèi)生物分布并評價(jià)其腫瘤靶向性,我們分離了對照組和各處理組的腫瘤組織和正常組織(心、肝、脾、肺、腎),進(jìn)行Western blot分析和免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示:TpB可選擇性地進(jìn)入腫瘤組織并在腫瘤中累積,而不會進(jìn)入各正常組織。為驗(yàn)證TpB的生物安全性,我們記錄了裸鼠體重變化,并對各正常組織進(jìn)行HE染色,結(jié)果表明各組裸鼠體重變化很小(在19-21 g之間波動),各組小鼠主要器官均未見明顯的形態(tài)學(xué)變化,說明TpB不會對這些正常器官造成損傷。綜上,我們首次設(shè)計(jì)并成功原核表達(dá)Beclin 1功能蛋白Trx-pHLIP-Beclin 1(TpB),在細(xì)胞和動物水平均證實(shí)其可以在弱酸性條件下將Beclin 1保守序列靶向遞送至腫瘤細(xì)胞或組織,通過誘導(dǎo)自噬來抑制腫瘤生長,并對正常器官沒有毒副作用。本研究可為進(jìn)一步設(shè)計(jì)和開發(fā)新型腫瘤酸度響應(yīng)策略提供新思路。
【學(xué)位單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R914;R96
【部分圖文】：

1.1.1 細(xì)胞自噬概述自噬在大多數(shù)細(xì)胞中以基本相同的速率發(fā)生，它是一種重要的、保守的溶酶體降解過程[1]，可清除功能紊亂細(xì)胞器或受損大分子，通過限制活性氧（ROS）產(chǎn)生和線粒體內(nèi)有毒蛋白質(zhì)釋放對細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用[2]。而異常自噬會引發(fā)很多疾病，如神經(jīng)退行性疾病、自身免疫性疾病、糖尿病、心臟病、傳染病、炎癥和癌癥等，這些疾病的發(fā)生與異常自噬密切相關(guān)[3-7]。1.1.2 細(xì)胞自噬過程細(xì)胞自噬過程如圖 1.1 所示，由雙膜結(jié)構(gòu)的自噬小體形成所引發(fā)的，自噬體在細(xì)胞質(zhì)中多個(gè)位置隨機(jī)形成，它將細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)固定在一個(gè)不降解的室里。自噬小體沿著微管向微管組織中心輸送，使它們接近溶酶體，隨后小泡與溶酶體融合，將受損細(xì)胞器、錯誤折疊的蛋白質(zhì)以及病原體進(jìn)行降解。細(xì)胞內(nèi)被降解物質(zhì)通過膜上的通透酶輸送到胞漿中得以重新利用[8]，在細(xì)胞外部營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)有限的情況下也可以作為代謝的替代能源，以維持細(xì)胞新陳代謝平衡增強(qiáng)生存能力。

Beclin 1 由 Beclin 1-Atg 14、Vps 34、p 150 和 NR成的起始和成熟過程中起著關(guān)鍵作用[24]。uces autophagy. Beclin 1-Vps34 complex I is comp0 and NRBF2. This type of class III PI3K complex of autophagosome formation[24].發(fā)生于人類染色體 17q21 上的一個(gè)腫瘤易感位高達(dá) 75 %）和前列腺癌（約 40 %）中自噬缺失[26,27]。在人乳腺癌細(xì)胞系和腫瘤組織中正常乳腺上皮中 Beclin 1 普遍高表達(dá)。因此以抑制腫瘤的發(fā)生，并在人乳腺癌中的表eclin 1 的表達(dá)減少可能有助于乳腺癌和其他 Beclin 1 則可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的死亡，抑制瘤治療研究者已經(jīng)將 Beclin 1 用于腫瘤治療。Li

1.3 正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞呼吸作用對比圖。(a)大多數(shù)正常細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸，葡萄糖產(chǎn)生的酮酸被吸收到三羧酸循環(huán)(線粒體)中。(b)腫瘤細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸[34]。igure 1.3 The respiratory profile. (a) Most normal cells engage in aerobicrespiration, whereyruvate generated from glucose is recruited into the Krebs cycle (mitochondria). (b) Glucoseonverted to lactic acid in cancer cells[34].1.3.2 pHLIP低 pH 插入肽（pH low insertion peptide, pHLIP）是來源于細(xì)菌視紫紅質(zhì) C 螺的一種水溶性多肽，由 AAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT 36 氨基酸組成[38 40]。pHLIP 有三種存在狀態(tài)，如圖 1.4 所示：第一種是以無結(jié)構(gòu)的狀溶解于水溶液中（State I）；第二種是作為一種無結(jié)構(gòu)的多肽與細(xì)胞膜表面松散結(jié)（State II）；第三種是在酸性條件下，通過形成穩(wěn)定的跨膜α螺旋將其 C 端插入細(xì)膜中（State III）[41]。因此，在酸性環(huán)境下 pHLIP 可通過形成穩(wěn)定的跨膜α-螺旋將接在其 C 端不能進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)遞送至細(xì)胞內(nèi)[42]。
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