第一部分:GSK-LSD1聯(lián)合PTX對(duì)細(xì)胞MGC803/PTX的抑制作用目的:通過(guò)計(jì)算聯(lián)合作用指數(shù)(combined index,CI)判斷聯(lián)用藥物的抗腫瘤效果,比較聯(lián)合用藥與單一用藥抑制細(xì)胞生存的能力。方法:MTT法檢測(cè)藥物單用于細(xì)胞的抑制率。選擇抑制率5%~30%之間的濃度進(jìn)行聯(lián)用濃度初篩,確定聯(lián)用時(shí)間;選擇最佳PTX濃度后再確定GSK-LSD1濃度,計(jì)算CI值。結(jié)果:成功確定GSK-LSD1與PTX聯(lián)用最佳時(shí)間為72h,最佳濃度分別為100uM及10nM,CI值為0.334,抑制率可達(dá)68.09%。第二部分:GSK-LSD1聯(lián)合PTX聯(lián)用組抗腫瘤作用及機(jī)制研究目的:研究聯(lián)用組對(duì)細(xì)胞MGC803/PTX的抗腫瘤作用及相關(guān)機(jī)制。1、聯(lián)用誘導(dǎo)細(xì)胞MGC803/PTX凋亡方法:熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞及細(xì)胞核的形態(tài)變化;平板克隆法檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力。Annexin V/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;Western blot檢測(cè)Total-PI3K、P-PI3K、Total-AKT、P-AKT(Ser473)、Bax、BCl-2、Total-caspase3、Cleaved-caspase3、Total-PARP、Cleaved-PARP等蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果:聯(lián)用組具有明顯破碎細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞核的能力;聯(lián)用組較單用組克隆形成率低,細(xì)胞凋亡率更高。以上結(jié)果表明聯(lián)用組誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其機(jī)制為下調(diào)P-PI3K、P-AKT(Ser473)、BCl-2的表達(dá);同時(shí)上調(diào)Bax、Cleaved-caspase3、Cleaved-PARP的表達(dá)。2、聯(lián)用抑制細(xì)胞MGC803/PTX轉(zhuǎn)移方法:細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。Western blot檢測(cè)ZO-1、Vimentin等蛋白的表達(dá)。結(jié)果:Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,聯(lián)用組較單用組更能抑制MGC803/PTX細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力,其具體機(jī)制為上調(diào)ZO-1的表達(dá)、下調(diào)Vimentin的表達(dá)。3、聯(lián)用促進(jìn)細(xì)胞MGC803/PTX發(fā)生自噬方法:DCFH-DA染色檢測(cè)胞內(nèi)活性氧含量;免疫熒光實(shí)驗(yàn)和透射電鏡觀察自噬體的產(chǎn)生。Western blot檢測(cè)LC3B、P62等蛋白的表達(dá);聯(lián)用組加入自噬抑制劑3-MA檢測(cè)LC3B、P62等蛋白含量的表達(dá)的逆轉(zhuǎn)變化。結(jié)果:DCFH-DA染色檢測(cè)到聯(lián)用組顯著增加胞內(nèi)活性氧含量;免疫熒光實(shí)驗(yàn)及透射電鏡觀察到聯(lián)用組產(chǎn)生更多自噬體。聯(lián)用組促進(jìn)細(xì)胞MGC803/PTX發(fā)生自噬,具體機(jī)制為上調(diào)LCII/LCI的比例、下調(diào)P62的表達(dá);聯(lián)用組加入3-MA后下調(diào)LCII/LCI的比例、上調(diào)P62的表達(dá)。結(jié)論:1.LSD1與微管蛋白是抗腫瘤藥物的兩個(gè)靶點(diǎn),將兩種靶點(diǎn)藥物相結(jié)合作用于耐藥細(xì)胞是一種新的藥物聯(lián)用方式。本課題確定了GSK-LSD1與PTX聯(lián)用的最佳時(shí)間為72h,最佳濃度分別為100μM及10nM,抑制率可達(dá)68.09%,CI值為0.334,根據(jù)Soriano等判斷方法0.2≤CI≤0.4為強(qiáng)協(xié)同作用;2.聯(lián)用組作用于MGC803/PTX后細(xì)胞及細(xì)胞核形態(tài)、克隆形成率、凋亡率等均發(fā)生明顯變化;聯(lián)用組下調(diào)P-PI3K、P-AKT(Ser473)、BCl-2的表達(dá);上調(diào)Bax、Cleaved-caspase3、Cleaved-PARP的表達(dá),說(shuō)明聯(lián)用組通過(guò)PI3K/AKT介導(dǎo)的凋亡通路誘導(dǎo)凋亡;3.聯(lián)用組較單用組明顯抑制了細(xì)胞MGC803/PTX轉(zhuǎn)移,同時(shí)上調(diào)ZO-1的表達(dá)、下調(diào)Vimentin的表達(dá),說(shuō)明聯(lián)用組可通過(guò)抑制轉(zhuǎn)移而抑制細(xì)胞增殖;4.與單用組相比,聯(lián)用組顯著增加胞內(nèi)活性氧及自噬體含量,且上調(diào)LCII/LCI的比例、下調(diào)P62的表達(dá),說(shuō)明聯(lián)用組促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生自噬。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R95
【部分圖文】：

藥物作用于MGC803/PTX細(xì)胞后細(xì)胞及細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化

圖 2.2 各組細(xì)胞的克隆形成能力及克隆形成率A.細(xì)胞克隆形成能力；B.克隆形成率表 2.1 四組克隆形成率統(tǒng)計(jì)Group Colony forming efficiency (%)

藥物作用于MGC803/PTX細(xì)胞的凋亡檢測(cè)A.細(xì)胞凋亡分布圖；B.細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)圖
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2870822