生物發(fā)光(bioluminescence)是發(fā)生在生物體內(nèi)的一種特殊類型的化學(xué)發(fā)光,生物發(fā)光不依賴外界的光,是體內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)在酶的催化作用下將化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽艿倪^程。生物發(fā)光成像技術(shù)具有非侵襲性、靈敏度高、選擇性好、可視化及能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。生物發(fā)光檢測工具逐漸被開發(fā)出來,有些已經(jīng)成功的應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)之中。常見的生物發(fā)光系統(tǒng)主要是螢火蟲螢光素酶生物發(fā)光系統(tǒng)、腔腸素螢光素酶生物發(fā)光系統(tǒng)與生物發(fā)光細(xì)菌系統(tǒng)。以咪唑并吡嗪酮為母核的腔腸素底物分布廣泛,能夠被多種螢光素酶催化發(fā)出藍(lán)色的光,而且不需要其他輔助因子。腔腸素螢光素酶生物發(fā)光系統(tǒng)比較簡單、底物有很好的生物相容性、背景熒光低、受干擾少,有利于研究體內(nèi)生理病理過程。腔腸素螢光素酶生物發(fā)光系統(tǒng)中研究最多的是海腎螢光素酶生物發(fā)光系統(tǒng),在氧氣的條件下底物被海腎螢光素酶氧化、環(huán)化,形成四元環(huán)中間體,四元環(huán)中間體很快發(fā)生裂解,產(chǎn)生CO2與激發(fā)態(tài)的酰胺類衍生物,酰胺類衍生物由激發(fā)態(tài)向基態(tài)躍遷的過程中,多余的能量以光子的形式釋放,發(fā)射出藍(lán)綠色的光。在腔腸素類似物的研究基礎(chǔ)上,我們分別設(shè)計(jì)、合成了二種小分子的生物發(fā)光探針:硝基還原酶(NTR)探針和硫化氫(H2S)探針,用于硝基還原酶與硫化氫的體內(nèi)外檢測。本論文主要包括:一、前言;二、海腎螢光素酶底物的合成;三、硝基還原酶探針的設(shè)計(jì)、合成以及評價(jià);四、硫化氫探針的設(shè)計(jì)、合成以及評價(jià)。腫瘤細(xì)胞缺氧通�？蓪�(dǎo)致胞內(nèi)的還原酶水平升高,例如硝基還原酶(nitroreductase),在缺氧條件下,以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nico-tinamide adenine dinucleotide,NADH)作為電子供體,外源性芳香族硝基化合物在硝基還原酶的催化下發(fā)生單電子轉(zhuǎn)移,生成硝基陰離子自由基,隨后進(jìn)一步被還原成羥胺或氨基�；谶@種還原行為我們設(shè)計(jì)了硝基還原酶生物發(fā)光探針檢測實(shí)體瘤的缺氧狀況。以4-硝基芐基、2-硝基芐基取代腔腸素類似物的羰基,當(dāng)硝基被還原成氨基后發(fā)生重排消除反應(yīng),釋放出底物,被酶催化發(fā)光,從而實(shí)現(xiàn)檢測硝基還原酶的目的。并且對探針的體外、細(xì)胞水平及動(dòng)物水平的應(yīng)用進(jìn)行了考察。結(jié)果表明,探針A1、A2、A5的相對生物發(fā)光強(qiáng)度與溶液中硝基還原酶的濃度呈良好的線性關(guān)系。在其他相關(guān)性物質(zhì)濃度是硝基還原酶濃度100倍以上情況下,探針A1、A2、A5相對生物發(fā)光強(qiáng)度是其他相關(guān)性物質(zhì)3倍以上,說明我們設(shè)計(jì)的生物發(fā)光探針具有良好的選擇性,在體外可實(shí)現(xiàn)對硝基還原酶的定性、定量檢測。在細(xì)胞水平上研究結(jié)果顯示探針A5表現(xiàn)出了良好的生物相容性,能夠用于檢測細(xì)胞內(nèi)源性硝基還原酶水平。并且A5可以用來檢測腫瘤區(qū)域的硝基還原酶水平,腫瘤區(qū)域生物發(fā)光強(qiáng)度與對照組相比增加了7倍。因此,我們設(shè)計(jì)的硝基還原酶探針能夠用于檢測腫瘤缺氧環(huán)境。硫化氫是調(diào)節(jié)血管、神經(jīng)、免疫系統(tǒng)重要的信號(hào)分子,細(xì)胞一旦無法維持正常的硫化氫濃度,就會(huì)出現(xiàn)各種疾病。為了更好的了解硫化氫在機(jī)體內(nèi)的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝過程,我們開發(fā)了一種新型硫化氫檢測方法。4-疊氮基芐基取代腔腸素類似物羰基后,底物不能被酶催化發(fā)光,當(dāng)疊氮基被硫化氫還原生成氨基后發(fā)生重排消除反應(yīng),釋放出底物,被酶催化發(fā)光,基于此我們設(shè)計(jì)了兩個(gè)硫化氫探針。在分子水平上探針表現(xiàn)出優(yōu)良的選擇性、靈敏度,相同條件下,硫化氫探針相對生物發(fā)光強(qiáng)度是其他相關(guān)性物質(zhì)的3倍以上。而且探針可以用于檢測細(xì)胞中的硫化氫水平。在動(dòng)物體內(nèi)上,探針C1硫氫化鈉組生物發(fā)光強(qiáng)度是生理鹽水組的4倍。因此,我們設(shè)計(jì)的基于海腎螢光素酶硫化氫探針能夠用于體內(nèi)硫化氫的檢測。我們以海腎螢光素酶生物發(fā)光體系為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)合成硝基還原酶和硫化氫探針,可以成功的用于細(xì)胞和生物體內(nèi)硝基還原酶和硫化氫的檢測,為研究與硫化氫相關(guān)的生理病理過程提供了一種新方法。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R91
【部分圖文】：

１．２．２腔腸素生物發(fā)光體系??以咪唑并吡嗪酮為底物的生物發(fā)光系統(tǒng)可以分為發(fā)光蛋白和莖光素酶類型??（圖１－２）。［２］由莖光素酶催化的生物發(fā)光反應(yīng)是典型的酶促反應(yīng)，其中底物被??〇２氧化產(chǎn)生處于激發(fā)態(tài)的產(chǎn)物（氧化莖光素），然后激發(fā)態(tài)向基態(tài)躍遷的過程中??發(fā)射出光。底物被螢光素酶完全催化。在發(fā)光蛋白類型的生物發(fā)光體系中，蛋白??質(zhì)形成穩(wěn)定的酶－底物復(fù)合物需很長時(shí)間。研究得最多的是一種Ｃａ２＋調(diào)控的載脂??蛋白。［７３］載脂蛋白與腔腸素非共價(jià)結(jié)合形成發(fā)光蛋白，然后在氧氣分子的作用??下形成氧化腔腸素。鈣離子與蛋白質(zhì)分子表面上的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合啟動(dòng)生物??發(fā)光。Ｃａ２＋的結(jié)合引起蛋白質(zhì)底物結(jié)合空腔中的構(gòu)象變化，使蛋白與２－羥基過氧??化腔腸素氫鍵斷開，引發(fā)氧化脫羧反應(yīng)，形成激發(fā)態(tài)的產(chǎn)物。［９］由于發(fā)光所必需??的底物已經(jīng)與發(fā)光蛋白結(jié)合，這不同于螢光素酶發(fā)光系統(tǒng)，因此只能反應(yīng)一次不??能反復(fù)幾次。反應(yīng)中涉及一個(gè)分子

螢光素酶是一種單體蛋白質(zhì)，其在氧氣的存在下催化腔腸素脫羧，形成腔腸酰胺，??釋放出二氧化碳和發(fā)射出藍(lán)光。［１１４４］海腎螢光素酶－腔腸素體系生物發(fā)光機(jī)制如??圖１－３所示：（１）首先０２與咪唑并吡嗪酮母核Ｃ－２位結(jié)合，生成過氧化物；（２）??過氧化物中間體迅速形成四元環(huán)中間體；（３）不穩(wěn)定的四元環(huán)中間體裂解釋放出??二氧化碳，同時(shí)生成激發(fā)態(tài)的酰胺類化合物；（４）酰胺類化合物由激發(fā)態(tài)向基態(tài)??躍遷的過程中，發(fā)射出藍(lán)綠色的光；（５）最終形成腔腸酰胺。??ｆ?ｎｈ?＾??Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ?ｎ＾ｎ??Ｈ〇?＂?０?Ｈ〇ｉｊ?＂＂Ｉ?Ｐｅｒｏｘｉｄｅ??Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｍｉｄｅ?ｋＪ＊??丨—？?１。－??０Ｙ＾－Ｏ＿０Ｈ?Ｒｅｎｉｌｌａ?Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ?〇??『ｎＹＮＳ?（３６?ｋＤａ）?ｒＮ?Ｎ８??．?ｏ＾－ｈ０＞－ｏｈ?ｊ?Ｄｉｏｘｅｔａｎｏｎｅ??ｉＹ９?－ｉ??．Ｊ?ｃ〇２??Ｓｉｎｇｌｅｔ?ｅｘｃｉｔｅｄ－ｓｔａｔｅ?ａｍｉｄｅ?ａｎｉｏｎ??圖１－３海腎螢光素酶－腔腸素體系發(fā)光機(jī)制??９??

Ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｉｎ?Ｃａ２＋－ｄｉｓｃｈａｒｇｅｄ?ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｉｎ??圖１－２螢光素酶和發(fā)光蛋白類型的生物發(fā)光系統(tǒng)［２］??海腎螢光素酶生物發(fā)光系統(tǒng)各種腔腸素生物發(fā)光系統(tǒng)中研宄比較多的。海腎??螢光素酶是一種單體蛋白質(zhì)，其在氧氣的存在下催化腔腸素脫羧，形成腔腸酰胺，??釋放出二氧化碳和發(fā)射出藍(lán)光。［１１４４］海腎螢光素酶－腔腸素體系生物發(fā)光機(jī)制如??圖１－３所示：（１）首先０２與咪唑并吡嗪酮母核Ｃ－２位結(jié)合，生成過氧化物；（２）??過氧化物中間體迅速形成四元環(huán)中間體；（３）不穩(wěn)定的四元環(huán)中間體裂解釋放出??二氧化碳，同時(shí)生成激發(fā)態(tài)的酰胺類化合物；（４）酰胺類化合物由激發(fā)態(tài)向基態(tài)??躍遷的過程中，發(fā)射出藍(lán)綠色的光；（５）最終形成腔腸酰胺。??ｆ?ｎｈ?＾??Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ?ｎ＾ｎ??Ｈ〇?＂?０?Ｈ〇ｉｊ?＂＂Ｉ?Ｐｅｒｏｘｉｄｅ??Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｍｉｄｅ?ｋＪ＊??丨—？?１。－??０Ｙ＾－Ｏ＿０Ｈ?Ｒｅｎｉｌｌａ?Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ?〇??『ｎＹＮＳ?（３６?ｋＤａ）?ｒＮ?Ｎ８??．?ｏ＾－ｈ０＞－ｏｈ?ｊ?Ｄｉｏｘｅｔａｎｏｎｅ??ｉＹ９?－ｉ??．Ｊ?ｃ〇２??Ｓｉｎｇｌｅｔ?ｅｘｃｉｔｅｄ－ｓｔａｔｅ?ａｍｉｄｅ?ａｎｉｏｎ??圖１－３海腎螢光素酶－腔腸素體系發(fā)光機(jī)制??９??
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本文編號(hào)：2870460