近年來(lái),納米系統(tǒng)應(yīng)用于治療內(nèi)耳疾病的研究發(fā)展迅速。圓窗膜作為物質(zhì)進(jìn)入中耳到內(nèi)耳的生物膜屏障,使大部分藥物難以滲透到圓窗膜進(jìn)入內(nèi)耳中,從而難以達(dá)到治療效果。因此研究納米系統(tǒng)跨圓窗膜的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制為提高轉(zhuǎn)運(yùn)效率及治療內(nèi)耳疾病非常重要。但是,目前關(guān)于納米系統(tǒng)從中耳轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)耳的過(guò)程、以及體內(nèi)外的轉(zhuǎn)運(yùn)行為的了解還很欠缺,認(rèn)識(shí)納米系統(tǒng)與圓窗膜相互作用機(jī)制仍然存在很大挑戰(zhàn)。本文通過(guò)對(duì)納米系統(tǒng)在體內(nèi)外生物相容性與攝取轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究,期望為納米系統(tǒng)在內(nèi)耳疾病治療中的應(yīng)用提供參考及借鑒。前期研究已經(jīng)合成基于CMCS/CC-CS納米粒與mPEG-PLGA納米粒相互作用形成的復(fù)合型納米粒,具有多重響應(yīng)、雙藥載藥聯(lián)合治療等優(yōu)點(diǎn),但該納米粒以及該類型的復(fù)合型納米粒應(yīng)用于內(nèi)耳遞送的研究非常匱乏。將分別包載尼羅紅、香豆素-6的CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒作為遞送系統(tǒng),對(duì)其體內(nèi)外生物相容性、體內(nèi)外攝取分布規(guī)律進(jìn)行了研究。體外細(xì)胞毒性及攝取結(jié)果表明在小于20 mg/mL濃度范圍內(nèi),CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒表現(xiàn)出輕微的細(xì)胞毒性,能被HEI-OC1細(xì)胞有效攝取,圍繞著細(xì)胞核分布,且呈現(xiàn)出一定的時(shí)間、濃度依賴性。利用斑馬魚(yú)模型研究CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒的胚胎毒性及攝取情況,結(jié)果表明CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒使斑馬魚(yú)胚胎的發(fā)育提前,并且這種影響具有濃度依賴性。斑馬魚(yú)攝取結(jié)果表明斑馬魚(yú)的側(cè)線毛細(xì)胞能夠有效的攝取CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒。以豚鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,研究CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒在內(nèi)耳組織的生物相容性及分布規(guī)律。通過(guò)蘇木精-伊紅染色評(píng)價(jià)CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒用于內(nèi)耳給藥的安全性,均表現(xiàn)出良好的生物相容性。體內(nèi)分布結(jié)果表明經(jīng)局部給藥后,CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒能夠有效被前庭組織中的感覺(jué)毛細(xì)胞及耳蝸組織中的感覺(jué)毛細(xì)胞攝取,且前庭組織的攝取量顯著大于耳蝸組織。為了更深入研究納米遞送系統(tǒng)在內(nèi)耳分布規(guī)律的機(jī)制,以豚鼠圓窗膜為模型考察了CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒對(duì)圓窗膜的通透性情況。采用激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)香豆素-6的綠色熒光與尼羅紅的紅色熒光在圓窗膜中廣泛分布,說(shuō)明該納米粒可以進(jìn)入圓窗膜。使用透射電子顯微鏡觀察經(jīng)局部納米粒給藥后收集的外淋巴液,結(jié)果顯示納米粒經(jīng)局部給藥后以完整的形式進(jìn)入到外淋巴液。選用1.7 mg/mL、5 mg/mL及15 mg/mL三個(gè)濃度點(diǎn)對(duì)納米�？鐖A窗膜進(jìn)行濃度依賴性考察,結(jié)果表明納米粒在圓窗膜內(nèi)的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。選用了15 min,30 min及60 min三個(gè)時(shí)間點(diǎn),對(duì)CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米�？鐖A窗膜進(jìn)行時(shí)間依賴性考察,結(jié)果表明0-30 min,納米粒在圓窗膜內(nèi)的熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間的增加而增加,但是在30-60 min,納米粒在圓窗膜的熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間的增加而降低。為了研究CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米�？鐖A窗膜的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,使用透射電子顯微鏡對(duì)鼓室注射CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒30 min后的豚鼠圓窗膜進(jìn)行觀察。與正常對(duì)照組相比,納米粒處理組的圓窗膜外上皮細(xì)胞及內(nèi)上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)了大量囊泡,圓窗膜的外上皮細(xì)胞的緊密連接增寬,結(jié)果表明CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒通過(guò)跨細(xì)胞及細(xì)胞旁路途徑進(jìn)入圓窗膜。緊接著為了探究跨細(xì)胞途徑的具體機(jī)制,使用不同的內(nèi)吞抑制劑、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑進(jìn)行研究。結(jié)果表明CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒主要以網(wǎng)格蛋白、小窩蛋白、巨胞飲介導(dǎo)的多種內(nèi)吞方式進(jìn)入圓窗膜,隨后進(jìn)入到溶酶體中,最后經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體介導(dǎo)的胞吐排出細(xì)胞進(jìn)入到外淋巴。圓窗膜作為物質(zhì)從中耳進(jìn)入到內(nèi)耳的途徑,但同時(shí)是阻止物質(zhì)進(jìn)入內(nèi)耳的生物膜屏障。低分子量魚(yú)精蛋白(LMWP)作為一種細(xì)胞穿膜肽,能夠介導(dǎo)生物大分子及納米粒穿過(guò)生物膜,為納米粒克服生物膜屏障提供了一種新思路。將LMWP修飾在PLGA納米粒表面上,研究該遞送系統(tǒng)應(yīng)用于內(nèi)耳給藥的體內(nèi)外行為。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,LMWP修飾的PLGA納米粒具有較低的細(xì)胞毒性,僅在高濃度時(shí)(≥2000μg/ml),LMWP修飾的PLGA納米粒才顯示出不可忽略的細(xì)胞毒性作用。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)LMWP修飾的PLGA納米粒在HEI-OC1細(xì)胞的攝取顯著高于未經(jīng)修飾的PLGA納米粒,且LMWP修飾的PLGA納米粒在30min、180min在細(xì)胞核有明顯的分布。在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)局部給藥后,使用小動(dòng)物活體熒光成像定量分析發(fā)現(xiàn)LMWP可以促進(jìn)納米粒進(jìn)入耳蝸。接下來(lái)對(duì)納米粒在圓窗膜的分布進(jìn)行了考察,結(jié)果表明LMWP可以促進(jìn)納米粒進(jìn)入圓窗膜,同時(shí)發(fā)現(xiàn)用羅丹明B標(biāo)記的LMWP僅在圓窗膜的外上皮層有分布,而香豆素-6標(biāo)記的PLGA納米粒在圓窗膜總體上都有分布。緊接著使用激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)未修飾PLGA納米粒與LMWP修飾PLGA納米粒在耳蝸感覺(jué)毛細(xì)胞的分布無(wú)明顯差異性。綜上所述,本課題系統(tǒng)的研究CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒在體內(nèi)外的生物相容性和攝取分布規(guī)律,并且闡明該納米粒跨圓窗膜的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,為提高轉(zhuǎn)運(yùn)效率及治療內(nèi)耳疾病具有重要的理論指導(dǎo)意義。對(duì)于LWMP修飾PLGA納米粒應(yīng)用于內(nèi)耳給藥,能有效增加體內(nèi)外的攝取與分布,為優(yōu)化內(nèi)耳遞送系統(tǒng)的設(shè)計(jì)提供參考,同時(shí)為獲得更佳的穿過(guò)生物膜屏障效率提供重要的研究基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R943
【部分圖文】：

圖 1-1 耳的結(jié)構(gòu)[3]耳疾病是指發(fā)生在耳蝸、前庭、聽(tīng)神經(jīng)等部位的病理性變化，常見(jiàn)耳聾、耳鳴、眩暈[4]。感音性聽(tīng)力損失約占發(fā)生耳聾病例的 90%，蝸或者聽(tīng)神經(jīng)部位發(fā)生病理變化引起。感音性聽(tīng)力損失分為噪音性老年性性聽(tīng)力損失、藥源性聽(tīng)力損失和梅尼埃病。正常人長(zhǎng)時(shí)間暴中，往往容易引起噪聲性聽(tīng)力損失[5]；其損傷機(jī)制為在強(qiáng)噪音的刺耳血流量以及供氧能力發(fā)生變化，降低了抗氧化酶和自由基清除

鼓室內(nèi)給藥方式仍需經(jīng)過(guò)圓窗膜屏障，所以耳蝸內(nèi)直接注射方式比鼓室內(nèi)給藥方式有效，但往往會(huì)顯著提高耳蝸相關(guān)疾病的危險(xiǎn)。在大多數(shù)情況下，局部藥物遞送使內(nèi)耳中的藥物濃度最大化，同時(shí)減少藥物副作用。由于這種“藥代動(dòng)力學(xué)優(yōu)勢(shì)”，局部給藥系統(tǒng)正成為治療內(nèi)耳疾病最常用的臨床治療方法[24]。1.2 納米遞送系統(tǒng)在內(nèi)耳疾病治療中的應(yīng)用通過(guò)藥物遞送來(lái)治療內(nèi)耳疾病面臨著很多挑戰(zhàn)，比如藥物進(jìn)入中耳腔后，部分藥物通過(guò)咽鼓管流失，導(dǎo)致進(jìn)入內(nèi)耳的藥物濃度大大減少。另一方面，由于圓窗膜的低滲透性，也會(huì)阻礙藥物進(jìn)入內(nèi)耳。這些障礙往往導(dǎo)致達(dá)到內(nèi)耳的藥物濃度相對(duì)低，達(dá)不到治療效果。納米�？捎刹煌牧现苽湫纬桑ǔＶ睆綇膸资綆装偌{米，可以用來(lái)包載各種藥物[25]。納米粒具有增加藥物溶解度、增加藥物的穩(wěn)定性、控制藥物的釋放和表面修飾用于特定的靶向作用等優(yōu)勢(shì)[26]。如圖 1-2，目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出許多用于內(nèi)耳藥物遞送的納米系統(tǒng)，包括脂質(zhì)核/殼納米粒、聚合物和共聚物、超順磁性氧化鐵納米粒、脂質(zhì)體等[27]。納米粒應(yīng)用于內(nèi)耳給藥已經(jīng)被證明可以通過(guò)圓窗膜成功的將生物材料遞送至內(nèi)耳中，但遺憾的是，靶向性納米粒的研究卻有限[28-30]。

圖 1-3 細(xì)胞穿膜肽進(jìn)入細(xì)胞三種可能的機(jī)制[56]圓窗膜作為物質(zhì)進(jìn)入中耳到內(nèi)耳途徑，但同時(shí)是阻止物質(zhì)進(jìn)入內(nèi)耳的生物膜屏障。如圖 1-4，圓窗膜由 3 層結(jié)構(gòu)構(gòu)成，包括外上皮層、中間纖維層、內(nèi)上皮層[57]。外上皮層主要為上皮細(xì)胞，細(xì)胞之間排列非常緊密，是構(gòu)成圓窗膜屏障的的主要結(jié)構(gòu)。由于圓窗膜的結(jié)構(gòu)，藥物在圓窗膜的滲透率低，從而導(dǎo)致藥物進(jìn)入到內(nèi)耳的濃度非常低而常常達(dá)不到療效。
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