近年來,納米系統(tǒng)應用于治療內耳疾病的研究發(fā)展迅速。圓窗膜作為物質進入中耳到內耳的生物膜屏障,使大部分藥物難以滲透到圓窗膜進入內耳中,從而難以達到治療效果。因此研究納米系統(tǒng)跨圓窗膜的轉運機制為提高轉運效率及治療內耳疾病非常重要。但是,目前關于納米系統(tǒng)從中耳轉運到內耳的過程、以及體內外的轉運行為的了解還很欠缺,認識納米系統(tǒng)與圓窗膜相互作用機制仍然存在很大挑戰(zhàn)。本文通過對納米系統(tǒng)在體內外生物相容性與攝取轉運機制的研究,期望為納米系統(tǒng)在內耳疾病治療中的應用提供參考及借鑒。前期研究已經合成基于CMCS/CC-CS納米粒與mPEG-PLGA納米粒相互作用形成的復合型納米粒,具有多重響應、雙藥載藥聯(lián)合治療等優(yōu)點,但該納米粒以及該類型的復合型納米粒應用于內耳遞送的研究非常匱乏。將分別包載尼羅紅、香豆素-6的CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒作為遞送系統(tǒng),對其體內外生物相容性、體內外攝取分布規(guī)律進行了研究。體外細胞毒性及攝取結果表明在小于20 mg/mL濃度范圍內,CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒表現(xiàn)出輕微的細胞毒性,能被HEI-OC1細胞有效攝取,圍繞著細胞核分布,且呈現(xiàn)出一定的時間、濃度依賴性。利用斑馬魚模型研究CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒的胚胎毒性及攝取情況,結果表明CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒使斑馬魚胚胎的發(fā)育提前,并且這種影響具有濃度依賴性。斑馬魚攝取結果表明斑馬魚的側線毛細胞能夠有效的攝取CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒。以豚鼠為實驗動物模型,研究CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒在內耳組織的生物相容性及分布規(guī)律。通過蘇木精-伊紅染色評價CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒用于內耳給藥的安全性,均表現(xiàn)出良好的生物相容性。體內分布結果表明經局部給藥后,CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒能夠有效被前庭組織中的感覺毛細胞及耳蝸組織中的感覺毛細胞攝取,且前庭組織的攝取量顯著大于耳蝸組織。為了更深入研究納米遞送系統(tǒng)在內耳分布規(guī)律的機制,以豚鼠圓窗膜為模型考察了CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒對圓窗膜的通透性情況。采用激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)香豆素-6的綠色熒光與尼羅紅的紅色熒光在圓窗膜中廣泛分布,說明該納米粒可以進入圓窗膜。使用透射電子顯微鏡觀察經局部納米粒給藥后收集的外淋巴液,結果顯示納米粒經局部給藥后以完整的形式進入到外淋巴液。選用1.7 mg/mL、5 mg/mL及15 mg/mL三個濃度點對納米�？鐖A窗膜進行濃度依賴性考察,結果表明納米粒在圓窗膜內的熒光強度呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。選用了15 min,30 min及60 min三個時間點,對CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米�？鐖A窗膜進行時間依賴性考察,結果表明0-30 min,納米粒在圓窗膜內的熒光強度隨著時間的增加而增加,但是在30-60 min,納米粒在圓窗膜的熒光強度隨著時間的增加而降低。為了研究CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米�？鐖A窗膜的轉運機制,使用透射電子顯微鏡對鼓室注射CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒30 min后的豚鼠圓窗膜進行觀察。與正常對照組相比,納米粒處理組的圓窗膜外上皮細胞及內上皮細胞發(fā)現(xiàn)了大量囊泡,圓窗膜的外上皮細胞的緊密連接增寬,結果表明CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒通過跨細胞及細胞旁路途徑進入圓窗膜。緊接著為了探究跨細胞途徑的具體機制,使用不同的內吞抑制劑、細胞內轉運抑制劑進行研究。結果表明CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒主要以網格蛋白、小窩蛋白、巨胞飲介導的多種內吞方式進入圓窗膜,隨后進入到溶酶體中,最后經內質網及高爾基體介導的胞吐排出細胞進入到外淋巴。圓窗膜作為物質從中耳進入到內耳的途徑,但同時是阻止物質進入內耳的生物膜屏障。低分子量魚精蛋白(LMWP)作為一種細胞穿膜肽,能夠介導生物大分子及納米粒穿過生物膜,為納米�？朔锬て琳咸峁┝艘环N新思路。將LMWP修飾在PLGA納米粒表面上,研究該遞送系統(tǒng)應用于內耳給藥的體內外行為。細胞毒性實驗結果表明,LMWP修飾的PLGA納米粒具有較低的細胞毒性,僅在高濃度時(≥2000μg/ml),LMWP修飾的PLGA納米粒才顯示出不可忽略的細胞毒性作用。細胞攝取實驗結果顯示,經LMWP修飾的PLGA納米粒在HEI-OC1細胞的攝取顯著高于未經修飾的PLGA納米粒,且LMWP修飾的PLGA納米粒在30min、180min在細胞核有明顯的分布。在體內動物實驗中,經局部給藥后,使用小動物活體熒光成像定量分析發(fā)現(xiàn)LMWP可以促進納米粒進入耳蝸。接下來對納米粒在圓窗膜的分布進行了考察,結果表明LMWP可以促進納米粒進入圓窗膜,同時發(fā)現(xiàn)用羅丹明B標記的LMWP僅在圓窗膜的外上皮層有分布,而香豆素-6標記的PLGA納米粒在圓窗膜總體上都有分布。緊接著使用激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)未修飾PLGA納米粒與LMWP修飾PLGA納米粒在耳蝸感覺毛細胞的分布無明顯差異性。綜上所述,本課題系統(tǒng)的研究CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA納米粒在體內外的生物相容性和攝取分布規(guī)律,并且闡明該納米�？鐖A窗膜的轉運機制,為提高轉運效率及治療內耳疾病具有重要的理論指導意義。對于LWMP修飾PLGA納米粒應用于內耳給藥,能有效增加體內外的攝取與分布,為優(yōu)化內耳遞送系統(tǒng)的設計提供參考,同時為獲得更佳的穿過生物膜屏障效率提供重要的研究基礎。
【學位單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R943
【部分圖文】：

圖 1-1 耳的結構[3]耳疾病是指發(fā)生在耳蝸、前庭、聽神經等部位的病理性變化，常見耳聾、耳鳴、眩暈[4]。感音性聽力損失約占發(fā)生耳聾病例的 90%，蝸或者聽神經部位發(fā)生病理變化引起。感音性聽力損失分為噪音性老年性性聽力損失、藥源性聽力損失和梅尼埃病。正常人長時間暴中，往往容易引起噪聲性聽力損失[5]；其損傷機制為在強噪音的刺耳血流量以及供氧能力發(fā)生變化，降低了抗氧化酶和自由基清除

鼓室內給藥方式仍需經過圓窗膜屏障，所以耳蝸內直接注射方式比鼓室內給藥方式有效，但往往會顯著提高耳蝸相關疾病的危險。在大多數(shù)情況下，局部藥物遞送使內耳中的藥物濃度最大化，同時減少藥物副作用。由于這種“藥代動力學優(yōu)勢”，局部給藥系統(tǒng)正成為治療內耳疾病最常用的臨床治療方法[24]。1.2 納米遞送系統(tǒng)在內耳疾病治療中的應用通過藥物遞送來治療內耳疾病面臨著很多挑戰(zhàn)，比如藥物進入中耳腔后，部分藥物通過咽鼓管流失，導致進入內耳的藥物濃度大大減少。另一方面，由于圓窗膜的低滲透性，也會阻礙藥物進入內耳。這些障礙往往導致達到內耳的藥物濃度相對低，達不到治療效果。納米�？捎刹煌牧现苽湫纬�，通常直徑從幾十到幾百納米，可以用來包載各種藥物[25]。納米粒具有增加藥物溶解度、增加藥物的穩(wěn)定性、控制藥物的釋放和表面修飾用于特定的靶向作用等優(yōu)勢[26]。如圖 1-2，目前已經開發(fā)出許多用于內耳藥物遞送的納米系統(tǒng)，包括脂質核/殼納米粒、聚合物和共聚物、超順磁性氧化鐵納米粒、脂質體等[27]。納米粒應用于內耳給藥已經被證明可以通過圓窗膜成功的將生物材料遞送至內耳中，但遺憾的是，靶向性納米粒的研究卻有限[28-30]。

圖 1-3 細胞穿膜肽進入細胞三種可能的機制[56]圓窗膜作為物質進入中耳到內耳途徑，但同時是阻止物質進入內耳的生物膜屏障。如圖 1-4，圓窗膜由 3 層結構構成，包括外上皮層、中間纖維層、內上皮層[57]。外上皮層主要為上皮細胞，細胞之間排列非常緊密，是構成圓窗膜屏障的的主要結構。由于圓窗膜的結構，藥物在圓窗膜的滲透率低，從而導致藥物進入到內耳的濃度非常低而常常達不到療效。
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