土壤放線菌能夠產(chǎn)生多種多樣的具有生物活性的天然產(chǎn)物,是抗生素的重要來源。其中,安莎霉素類抗生素是一類以3-氨基-5-羥基苯甲酸(3-amino-5-hydroxybenzoic acid,AHBA)為起始單元的結(jié)構(gòu)獨特的大環(huán)內(nèi)酰胺類化合物,具有良好的生物活性,故而從土壤放線菌中挖掘具有成藥潛力的新型安莎霉素成為我們的研究目標(biāo)。AHBA合酶是安莎霉素類化合物合成的關(guān)鍵酶,且AHBA合酶基因在不同的菌株中具有高度保守性,本課題組的宋任泰博士從全國各地的土壤中以AHBA合酶基因為靶向進行PCR篩選得到80株AHBA合酶基因陽性菌株。本研究論文以其中的三株AHBA陽性菌Streptomycessp.S051、Streptomyces sp.S006和Streptomycessp.S035為研究材料,對其次級代謝產(chǎn)物進行了系統(tǒng)的研究。運用葡聚糖凝膠(SephadexLH-20)、中壓液相相柱層析(RP-18)、硅膠柱層析(Silica gel)以及高效液相色譜(HPLC)等多種技術(shù),共分離得到了 29個化合物,并利用紫外(UV)、紅外(IR)、質(zhì)譜(MS)、核磁共振(NMR)和X-ray單晶衍射等技術(shù)鑒定了其結(jié)構(gòu),其中12個為新合物,包括1個萘醌類化合物,4個萜類化合物和7個五酮安莎霉素類化合物。對菌株Streptomycessp.S051的固體YMG培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物進行提取分離和結(jié)構(gòu)鑒定,共得到8個化合物,其中1個新的萘醌類化合物A13(4),未得到安莎霉素類抗生素,推測安莎霉素基因簇在此株菌中低表達或者不表達。對菌株Streptomyces sp.S006的固體Waksman培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物進行提取分離和結(jié)構(gòu)鑒定,共得到7個化合物,包括4個新的萜類化合物(B12、B13、B4和B6,12-15)并對其進行了抗菌活性的測定,化合物均未顯示出明顯活性。本次分離未得到安莎霉素類化合物,推測安莎霉素基因簇在此株菌中低表達或者不表達。對菌株Streptomyces sp.S035安莎霉素基因簇中的正調(diào)控因子LAL和SARP進行共表達構(gòu)建了突變株S035-SL。對突變株Streptomyces sp.S035-SL的固體燕麥基發(fā)酵產(chǎn)物進行提取分離和結(jié)構(gòu)鑒定,共得到14個化合物,包括7個結(jié)構(gòu)新穎的五酮安莎霉素(SL31、SL27、SL14、SL6、SL8、SL12 和 SL13,16-22)。選取HeLa、SW480、PC3和HCT116四株癌細胞對化合物16-22進行了細胞毒性測定,其中化合物SL6、SL27和SL14均顯示出了細胞毒作用,SL8和SL12對不同細胞株具有選擇性抑制作用。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R915
【部分圖文】：

Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｔｈｅ?ｔｙｐｉｃａｌ?ａｎｓａｍｙｃｉｎｓ??安莎霉素類抗生素是從植物或者微生物體內(nèi)分離得到的一類大環(huán)內(nèi)酰胺類??抗生素（圖１．１），其結(jié)構(gòu)特征是共同的前體化合物３－氨基－５－羥基苯甲酸（ＡＨＢＡ）??３５，ＡＨＢＡ的生物合成是ａｍｉｎｏＤＨＳ在ＡＨＢＡ合酶特異性的催化下生成的（圖??１．２，圖片１．２引自參考文獻４Ｇ），因此ＡＨＢＡ合酶基因被用作系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記的特??定基因來定位新的安莎霉素。根據(jù)其生物合成中聚酮鏈的延伸次數(shù)，已發(fā)現(xiàn)的安??莎霉素類抗生素可以分為５酮、７酮、８酮、９酮、１１酮和１４酮，但是６酮、１０??酮、１２酮、１３酮和大于１４酮的安莎霉素尚未發(fā)現(xiàn)。通過擴增ＡＨＢＡ合成酶基??因中的簡并引物來篩選ＡＨＢＡ陽性菌株３６＿３７。由己知序列和ＰＣＲ擴增子序列構(gòu)??建了系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)它們的安莎霉素亞家族揭示了?ＡＨＢＡ合酶基因的分支３６??（圖１。２）。除了安沙霉素類抗生素外，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹還分析得到了小單孢菌屬??中含ＡＨＢＡ的雜合ＰＫＳ－ＮＲＰＳ基因簇的進化枝，以及ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ基因簇中ｍｉｔＡ??序列形成的進化枝３７。通過優(yōu)化培養(yǎng)基

?ＬＣ６中，過表達正調(diào)控因子得到了?２個結(jié)構(gòu)新穎的五酮安沙霉素ｊｕａｎｌｉｍｙｃｉｎｓ?Ａ??和Ｂ?３８?（圖１．２）。在另一株鏈霉菌ＬＺ３５中過表達特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（ｎａｍｌ），??成功地激活沉默的安沙霉素基因簇并得到了新的安莎霉素ｎｅｏａｎｓａｍｙｃｉｎｓ?Ａ－Ｃ?３９??（圖?１．２）。??ＣＯＯＨ?ＣＯＯＨ??Ｉ?ＡＨＢＡ?ｓｙｎｔｈａｓｅ??｜〇〇?ｓ藍織?ｎ?〇ｊｈ〇＾ｎｈ２??，〇°?”溫〇Ｈ?ＡｈｂＡ??：防，＇Ｖ二，一?ａｍｉｎｏＯＨＳ?；??．〇〇?ｗ?／?ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ａｎａｌｙｓｉｓ??Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ?ｓｐ．?ＬＣ６??，ｍ?ＪｕａｎｌｌｍｙｄｎＡ?Ｒ＝??二二＿ｉ；?？ｆｉ＝：ｎ?ｒＨ??＇?ｖ＾：．Ｉ?ＨＯＯＣ＾＾Ｏ?ｊｕａｎｌｉｍｙｃｉｎＢ?Ｒ?＝??００??？?〇Ｈ?ｒ?ｊ?＼?，??ｒ＊Ａ?ｎ?ｖ＊４ｉｉ＇Ｈ??Ｖ，?１Ｉ．Ｘ５０４８７Ｓ）???１００?Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ?ｓｐ．?ＬＺ３５??晰說獅＝?？?Ｈ?＾?？?？?ｎ??￣?；￣ｒ?咖洲郵納?ｒｒ＼ｒ?ｒｒＶＹ??＂?ｔａ３?加？如丨Ａｈｗ丨產(chǎn)?Ｈｏ＾Ｓ－＾＾ｃｙＳｒＲ??（Ａｉｘ?Ｍｕｎ?ａｅｔＫｆｉ＊４?ｒ?Ｕ＾？ｖｗｗａｗ?ｔｐｆ?Ｉ?ＪＬ?／?ｉ??＜?＞＂ｙ＇?？？ｉ?－?ｉＶｕｈｆ????，Ｋ?啊－—?ｎｅ〇８ｎＳａｍｙＣｍＡ?－＾ｎ＾ｍｙｃｎＢ?Ｒ

與Ｃ－１２ａ存在ＨＭＢＣ相關(guān)信號，Ｈ－１２ｂ與Ｃ－６ａ，?Ｃ－１２ａ存在ＨＭＢＣ相關(guān)信號以及??角甲基質(zhì)子Ｍｅ－１４，?Ｍｅ－］５與Ｃ－５，?Ｃ－４ａ處存在ＨＭＢＣ信號，通過ＨＭＢＣ信號將??結(jié)構(gòu)連接起來（圖３．３）。經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索和核磁數(shù)據(jù)對比，化合物Ａ７為己知化合??物?ｎａｐｈｔｈｇｅｒａｎｉｎｅ?Ａ４４＿４６〇??Ｈ。滅‘：??ＯＨ?〇??圖３．３化合物Ａ７?（１）重要的ＣＯＳＹ和ＨＭＢＣ相關(guān)信號??Ｆｉｇｕｒｅ?３．３?Ｋｅｙ?ＣＯＳＹ，?ＨＭＢＣ?ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?Ａ７?（１）??（見電子版文件夾Ｓ０５１）??表?３．１．化合物?Ａ７?（１）的?ＮＭＲ?數(shù)據(jù)（４００?ＭＨｚ，?ｄｉｎ?ｐｐｍ，＾?ｉｎ?Ｈｚ）??Ｔａｂｌｅ?３．１．?Ｔｈｅ?ＮＭＲ?ｄａｔａ?ｏｆ?ｃｏｍｐｏｕｎｄ?Ａ７?（１）?（４００?ＭＨｚ，?Ｊｉｎ?ｐｐｍ，?Ｊ?ｉｎ?Ｈｚ）??（見電子版文件夾Ｓ０５１）??Ｐｏｓ．?ｄＨ?Ｓｃ?＇Ｈ－＇Ｈ?ＣＯＳＹ?ＨＭＢＣ??１?５．９９?（ｄ，?４．２）?１２０．７ｄ?Ｈ－１２ｂ，?Ｍｅ－１３?Ｃ－２，?Ｃ－３，?Ｃ－４ａ，?Ｃ－１３??２?１３５．６ｓ??３?１．９７?（ｍ）?２９．６ｔ?Ｈ－４?Ｃ－ｌ，Ｃ－４，?Ｃ－１３??４?１．１８?（ｍ）?２０．３ｔ?Ｈ－３?Ｃ－３，?Ｃ－４ａ??１．８９?（ｍ）?Ｃ－２，?Ｃ－４ａ??４ａ?１．８０?（ｍ）?３９．Ｉｄ?Ｈ－ｌ
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 殷瑜;戈梅;陳代杰;;新方法新技術(shù)與新型抗生素發(fā)現(xiàn)[J];微生物學(xué)通報;2013年10期

2 何慶;李青連;王麗非;洪斌;;基于微生物基因組的新型天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)策略[J];國際藥學(xué)研究雜志;2012年01期

3 趙世萍;章育中;;葛根中異黃酮含量的薄層光密度法測定[J];藥學(xué)學(xué)報;1985年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 張治強;八株土壤放線菌次級代謝產(chǎn)物的研究[D];山東大學(xué);2017年

本文編號：2850460